UNIVERSIDAD SAN FRANCISCO DE QUITO LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Daniela Egas 00124723, María Belén Veloz 00123943 , María José Tobar. 8 de noviembre de 2016 1. TEMA: DNA Dot Blot 2. INTRODUCCIÓN:
Dot Blotting se conoce como una técnica de una especificidad alta que se usa en los casos donde se necesita una región de ADN específico, esta permite la detección, análisis e identificación de proteínas directamente sobre la membrana. Una de las características que presenta esta técnica es que las muestras van van a ser recubiertas recubiertas sobre un material material de soporte sólido a diferencia de otras técnicas que presentan separación por electroforesis ( Vanderbilt Institute of Chemical Chemical Biology,2012). Biology,2012). En este método lo que se realiza es una desnaturalización desnaturalización que puede darse mediante la temperatura temperatu ra o métodos métodos químicos. La utilización de sonda de ácidos ácidos nucleicos permite permite reconocer la presencia de un segmento segmento de ADN en específico en la muestra por hibridación y luego por una reacción colorimétrica que al adicionar un sustrato de forma f orma específica para la enzima que está conjugada a la molécula detectora (Lara & Iturralde, 2009). Existen otro tipo de técnicas que son similares a la dot blot, una de ella se conoce como hibridación in situ, puesto que las sondas que se utilizan son añadidas directamente a la muestra donde el ácido nucleico se encuentra inmovilizado, en esta técnica puede darse en preparaciones de cromosomas, cromosomas, espécimes citológicos, citológicos, entre otros (García, 2009). Otras técnicas de hibridación que se caracterizan caracterizan por ser en soporte sólido son el Southem blot y el Northem blot. El primero se utiliza igual para detectar ciertas secuencias secuencias complementarias complementarias de ADN mediante moléculas que han sido marcadas con radioactividad y el segundo se utiliza para detectar genes genes que están están transcriptos en algunas condiciones, condiciones, utilizado para para RNA. Otra de las técnicas importantes para la identificación de la presencia de una banda concreta en un gel que este caso son proteínas es conocida como Westerm blot, el cual se usan anticuerpos que están marcados con radioactividad (Rojas, 2013).
3. RESULTADOS:
CORRECTO
INCORRECTO
DESCRIPCIÓN:
En el cultivo del humano se marcó ya que es el que contiene el gen específico, el cultivo de la bacteria no se marcó entonces no tiene el gen específico, el cultivo del insecto tampoco se marcó ya que no tiene el gen. la sonda está claramente marcada porque es el control que contiene la secuencia complementaria al gen específico, entonces la sonda está correcta.
4. DISCUSIÓN: La actina pertenece a la familia de las proteínas globulares que son necesarias para el movimiento de las eucariotas. El gen de la β-Actina suele ser usado como un control positivo de la retrotranscripción o de la expresión para distintas especies. Se espera encontrar el gen de la β-Actina en las muestras de humanos ya que este gen corresponde a un gen que se ha identificado en humanos y esta secuencia de este gen es altamente homólogo en aves, ratas, ratones o cualquier tipo de animales vertebrados. Esto quiere decir que este gen necesariamente va a estar ausente en las muestras tanto de bacterias como en la de insectos. La Beta actina se utiliza generalmente como un control de carga, sirve para la integridad de las células, la degradación de proteínas, en la PCR y Western Blot.
La sonda es un fragmento de ADN usado en la biología molecular para detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia similar o igual. La sonda se une a la muestra de ADN mediante un mecanismo de hibridación que consiste en formar una estructura bicatenaria en la que una de las hebras pertenece a la sonda la otra hebra pertenece a la secuencia diana. Esta unión se da ya que tanto la sonda como la diana tienen secuencias complementarias, así se forman pares de bases complementarias(Ecured, 2016). Nuestro grupo de trabajo tuvo dificultades para obtener los resultados esperados en el DNA dot blot ya que no hay marcas en el nylon. La sonda logró salir en el nylon entonces esto quiere decir que no hubo problema con el reactivo. Esto quiere decir que el error ocurrió durante la preparación de las muestras, esto puede estar relacionado por contaminación de las muestras ya que se pintó el de la bacteria pero no la del humano.
Los microarreglos es un tipo de formato experimental o tecnología que se basa en la síntesis o en la fijación de sondas que representan los genes (metabolitos, proteínas) en un sustrato sólido como el plástico o el cristal, los cuales están expuestos a muestras o moléculas diana (Velandia, 2016). Esta tecnología es usado en investigaciones sobre genética y sobre todo en estudios sobre cáncer. Al realizar estos microarreglos, la sonda o molécula diana se hibrida generando fluorescencia y se logra medir mediante análisis de imagen. En el genoma humano, existen combinaciones de genes que se encuentran apagadas mientras que otras están prendidas, entonces gracias a estos microarrays se puede saber cuales están prendidos o apagados y se puede detectar la presencia de ciertos genes específicos (Medina et al, 2009). Las etapas que se realizan para esta técnica es la extracción de ARN, seguido por la síntesis y marcado de ADN complementario, luego se realiza la hibridación seguido por la cuantificación y la lectura y finalmente el análisis del microarreglo (Salcedo et al, 2010). El Dot Blot es una técnica que permite reconocer una proteína o secuencia de ADN. Por lo tanto el mecanismo de función del microarreglo se relaciona con la práctica de Dot Blot ya que según el perfil que se obtiene de la expresión génica se logra reconocer proteínas que se encuentran en las células en ciertos momentos específicos. De misma manera los dos mecanismos usan la etapa de hibridación (González, 2006).
5.
REFERENCIAS:
García, M. (2009). HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: FUNDAMENTOS Y APLICACIONES. Recuperado el 8 de noviembre de 2016 de http://iris.paho.org/xmlui/bitstream/handle/123456789/16713/v109n3p244.pdf?sequen ce=1 González, F. (2006). Ensayos médicos sobre genética. Quito: Noción. Lara, J. C., & Iturralde, J. R. (2009). Desarrollo y análisis del sistema conjunto PCR/Dot Blot para la detección del virus de la Necrosis hipodérmica y Hematopoyética infecciosa. Recuperado el 8 de noviembre de 2016 de https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/6943/1/Desarrollo%20y%20A nálisis%20del%20Sistema%20Conjunto%20PCRDot%20Blot.pdf Medina, E et al. (2009). Microarreglos: Tecnología con aplicaciones en el campo de la salud humana. 6/11/2016, de Instituto Nacional de pediatría Sitio web: http://www.medigraphic.com/pdfs/alergia/al-2009/al092c.pdf Rojas, D. (2013). Fundamentos de técnicas blotting: Southern, Northern, Western. Recuperado el 8 de noviembre de 2016 de http://es.slideshare.net/CarolinaHerrera151/fundamentos-de-tcnicas-blotting-southernnorthern-western
Salcedo, J et al. (2010). Microarreglos de ADN: fabricación, proceso y análisis. 6/11/2016, de Inecc gob Sitio web: http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/microarreglos.pdf Vanderbilt Institute of Chemical Biology. (2012). Dot Blot. Recuperado el 8 de noviembre de 2016 de https://www4.vanderbilt.edu/vapr/dot_blot Velandia, W. (2016). Microarrays. 6/11/2016, de Universidad de Cundinamarca Sitio web: https://www.youtube.com/watch?v=uc0z7l4jDgY
