GÉNIE FERMENTAIRE S4_IAB3 / S4_GE2
Modules S4IAB3 et S4GE2 IAB)) Mr Bennasroune Génie génétique (GE + IAB Cours : 12h TD : 6h TP : 8h
r
a m eau
Cours : 4h TD : 2h
IAB)) : moi Génie fermentaire (GE + IAB Cours : GE : 12h IAB : 14h TD : GE : 6h IAB : 8h TP : GE : 8h IAB : 20h
Evaluation génie fermentaire 1 note = 4 IE début de cours cours (4x5pts) 1 note IE fin de module (≈ (≈ fin mars, coef 2) 1 note (GE) / 3 notes (IAB) de TP
Méthodes, particularités synthèse de diverses disciplines visée pratique documents prise de notes bibliographie : Biotechnologies, R. Scriban
Génie fermentaire Introduction
Définition BIOBIO-TECHNOLOGIE Utilisation d'éléments du vivant à des fins d'applications industrielles, industrielles, agricoles ou médicales OCDE (1980) : mise en œuvre de matériel biologique pour une production de biens et de services.
Biotechnologies Génie fermentaire
Micro-organismes Plantes
Génie énéti ue
OGM
Animaux
Génie enzymatique
ENZYMES
Un peu d’histoire… Pffouuu, la barbe… Je hais l’histoire…
Quelques milliers d’années plus tôt…
Fin XIXe : relation microorganismes / fermentation
1861
Première moitié XXe : premières productions industrielles Première guerre mondiale : glycérine
Première moitié XXe : premières productions industrielles
1928
Deuxième guerre mondiale : pénicilline
Depuis 1973 : génie génétique
Applications actuelles
Applications environnementales : dépollution Dépollution de sols
Dépollution des rejets gazeux (COV)
Dépollution des eaux
Production de bio gaz par méthanisation de déchets
Applications : productions Médicaments : protéines recombinantes
Médicaments : antibiotiques
Bioéthanol
Applications : production Additifs alimentaires
Bioplastiques : PLA…
Enzymes : chymosine
Avantages du vivant spécificité des réactions
Avantages diversité des réactions
Avantages conditions réactionnelles douces auto entretien des cellules
Inconvénients complexité de mise en œuvre rentabilité variabilité
Outils du génie fermentaire microbiologie dosages biochimiques et chimiques automatisme modélisation mathématique …
synthèse de divers champs de connaissances
Etapes Génie génétique
obtenir le micro-organisme • sélection • ‘cré ‘créat atio ion’ n’ par par modif modific icat atio ion n AD ADN N • faisabilité • rentabilité
mettre mettre en œuvre œuvre à l ’échell ’échelle e indus industri triell elle e Génie fermentaire
Laboratoire Industriel
Pilote
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs
Cinétiques… Acquérir : X S
X
S temps
X
S
P
P
temps
calculer
comparer
sélectionner optimiser
X
S
P dX/dt = f (t, T, pH, S…) -dS/dt = f (t, X, S…) dP/dt = f (t, X, S…) temps
modéliser prévoir et contrôler dN/dt = rN(1-N/Nmax)(1-Nmin /N)c
Laboratoire Industriel
Pilote
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs
2. Vue d’ensemble
T, pH, pot redox…
X
S P
Notion de maintenance
‘’On ne se baigne jamais deux fois dans le même fleuve’’ Héraclite
Utilisation du substrat P S
X
Répartition
m/P/X dépend : …
Utilisation du substrat S
P
X
Yx/s = g de X formé / g de S consommé Yp/s = g de P formé / g de S consommé m = g de S consommé / g de X
Rendements Rendement global ou final: P - Po –
dS/dt
P
X - Xo -
Rendement instantané : dP/dt
X
S
S
X P
Soit dP/dS, dX/dS
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble
3. Cinétique de la biomasse 3.1 courbe de croissance
LnX LnXf LnX2
LnX1 LnXo
Milieu non renouvelé (batch) s e l u l l e c e d
Au moins 1 paramètre limitant... Croissance non non limi limité téee
r b m o n u d n L
Adaptation au milieu
Temps
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble
3. Cinétique de la biomasse 3.1 courbe de croissance
3.2 paramètres de la croissance
Rappels g
population
X
individu
16 ; 16X
g
8 ; 8X
g
=
(t 2
t ). ln 2
− 1
(ln X 2
−
ln X 1 )
g
4 ; 4X 2 ; 2X 1;X
g g
g temps
Détermination graphique de g Biomasse X
X2=2X1 X1
t1 g t2
Temps
Ln X
Ln(2X1) = LnX1 + Ln2 Ln2
ln(X1)
t1 g t2
Temps
Vitesse de croissance expression d’une vitesse : quantité / unité de temps : km/h , pizzas/jour dX / dt = biomasse formée / h ’
Vitesse spécifique de croissance
Vitesse spécifique de croissance exercice préparatoire ☺ : Cinétique de la production de frites dans deux cabanes à frittes concurrentes emps
11h00-14h00
pro uc on cabane 1 120 kg
pro uc on cabane 2 180 kg
Vitesse spécifique de croissance exercice préparatoire ☺ : Cinétique de la consommation de frites dans deux cabanes à frittes concurrentes emps
conso cabane 1
11h00-14h00
120 kg
conso cabane 2
v esse e production
180 kg
40 kg/h
Dans quelle cabane les employés fabriquent-ils le plus de frittes chacun ? Lesquels je vais virer ???
v esse e production 60 kg/h
Vitesse spécifique de croissance Temp s
Vitesse de conso cabane 1
Cas b
3
40kg/h
60kg/h
1
2
40
30
Cas c
3
40kg/h
60kg/h
2
2
20
30
Vitesse spécifique de croissance = µ x
Vitesse Nombre Nombre Prod. Prod de d’emplo d’emplo Par par conso yés yés emplo employ cabane cabane cabane yé é 2 1 2 Caban Caban e1 e2
µ x
=
dX 1 . dt X
Vitesse spécifique de croissance (µx) croissance = réaction d’ordre 1
r x
D'où :
µ x
=
=
dX dt
=
µ x . X
dX 1 . dt X
En h-1 ou mn-1 En fait : g
de X / g de X / h
µ x
=
dX 1 . dt X
Le X de 1/X = X moyen sur un dt petit
X
Représente bien la valeur moyenne
Ne représente pas la valeur moyenne
temps Bien vérifier que X varie linéairement sur le dt choisit
Évolution de µx
lnX
µ x max
µx
µx dépend de : - la souche - le milieu - la T - l e pH -……….
en intégrant de t1 à t2
µ x
=
(ln X 2
−
ln X 1 )
t
−
t
Ln X
Ln X2 Ln X1
Pente = µ t1 t2
Temps
Méthode la plus simple et la plus fiable pour calculer µx.
Relation entre g et µx
µ x
=
(ln X 2 (t 2
−
ln X 1 )
t )
g
− 1
g
=
ln 2
µ x
=
(t 2
t ). ln 2
− 1
(ln X 2
−
ln X 1 )
Exploitation des mesures Temps
0
1
2
3
4
5
6
Biomass e X
20
20
30
50
90
80
90
n
,
,
,
,
,
,
,
Ln X
Tem s
Mesure du temps de latence
LnX0
0 Temps de latence
Ln X
µx demandé : Pente = µ Temps Ln nombre de cellules
g demandé : ln2
g
Temps
Conseils importants Par le calcul g
=
(t 2
t ). ln 2
− 1
(ln N 2
−
ln N 1 )
(ln X 2 x
(t 2
−
ln X 1 )
t )
− 1
Graphiquement
Paramètres de croissance à déterminer durée phase de latence : lag vitesse spécifique de croissance : µx temps de génération : g Eventuellement : concentration initiale : Xo concentration finale : Xmax
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble
3. Cinétique de la biomasse 3.1 courbe de croissance 3.2 paramètres de la croissance
3.3 influence de la température
EFFET de la TEMPÉRATURE sur la CROISSANCE Optimale Topt x
µ e c n
s s i o r c e d e s s e t i V
Maximale
Minimale
Tmax
Tmin
Température
En fonction Topt cryophiles psychrophiles mésophiles thermophiles hyperthermophiles µ x
pH ou T°
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble
3. Cinétique de la biomasse 3.1 courbe de croissance 3.2 paramètres de la croissance 3.3 influence de la température
3.4 influence du pH
EFFET du pH sur la CROISSANCE CROISSANCE Gamme de pH 3 à 4 U pH
pH optimal
pHmin
pHmax
pH
En fonction du pHopt alcalinophiles neutrophiles acidophiles
µ x
pH ou T°
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble
3. Cinétique de la biomasse 3.1 courbe de croissance 3.2 paramètres de la croissance 3.3 influence de la température 3.4 influence du pH
3.5 autres facteurs de variation
Autres facteurs composition nutritive du milieu teneur en eau / P osmotique (= aw) Po2 / potentiel redox densité de population µ X (1 − = µX dt
X f
)
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse
4. Cinétique du substrat 4.1 vitesse spécifique de consommation
réaction d’ordre 1
r s =
D'où :
µ s
=
dS
= µ s . X
dS 1 . dt X
En h-1 ou mn-1 En fait : g
de S / g de X / h
S
Détermination de µs X
dS X2 1
X = (X1+X2)/2
dt
µ s
=
dS 1 . dt X
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse
. 4.1 vitesse spécifique de consommation
4.2 équation de Pirt C’est pirt que tout !!!
Vitesse de consommation de S BIOMASSE
SUBSTRAT
MAINTENANCE
PRODUIT(S)
Vitesse de consomm ation du S
=
Vitesse de consomm ation du S pour faire X
+
Vitesse de consomm ation du S pour la maintenan ce
+
Vitesse de consomm ation du S pour faire P
Equation de Pirt µ S s
=
dS 1 . dt X
=
1
Y ' X / S
. µ X
+
m+
1
Y ' P / S
.µ P
=
Y’ = rendement particulier / théorique C6H12O6 180g
2 CH3CH2OH + 2 CO2 2x46 = 92g
Y’p/s = 92/180 = 0,511
≠
Y
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse
. 4.1 vitesse spécifique de consommation 4.2 équation de Pirt
4.3 influence de S sur x
Le shhubstra t…
Hips …
Ch’est trè bon, ouaip !
Loi de Monod µ x
=
µ x max
S 2 Ks + S + ( S / K I )
Inhibition par le substrat µxmax
µxmax /2
µ x
=
µ x max
S Ks + S
Ki
Intérêt de Ks espèce A : Ks = 1 mM ; µx = 0,5 h-1 espèce B : Ks = 0,1mM ; µx = 0,5 h-1 max
max
si S = 0,5 mM : … si S = 10 mM : …
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse .
5. Cinétique du produit 5.1 vitesse spécifique de production 5 en 4 ans, faudrait que ça cesse !
µ p =
dP 1 . dt X
µ p = g de P formés par h et par g de biomasse
Détermination : comme pour µs
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse .
5. Cinétique du produit 5.1 vitesse spécifique de consommation
5.2 association avec la croissance
Association avec la croissance En réacteur fermé : 3 cas X
P
Associé à la croissance = métabolite primaire
dP
ex : éthanol (levures)
dt
=
Y P / X .µ X .X
temps
X
P
Non associé à la croissance = métabolite secondaire ex : antibiotiques temps
dP dt
=
β . X
X
Association mixte
dP dt
P temps
=
α . µ X .X+ + β β . X .X
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse .
5. Cinétique du produit 5.1 vitesse spécifique de consommation 5.2 association avec la croissance
5.3 inhibition de la croissance par les produits
µ
=
µ max
S K S
+
.
K I
P S K I + I
exemples : éthanol (levures), acétate (E. coli )
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse . 5. Cinétique du produit
6. Productivité
Calcul de la productivité prod uctivité en biomasse Productivité volumique horaire = (Xf - Xo Xo)) / durée totale g de X / L / h
X (g/L)
Xf
Xo Temps
0
V, N, R, S
culture
t
(h)
ensemencement
Durée totale du process = V : vidange ; N : nettoyage ; R : remplissage ; S : stérilisation ; culture
Calcul de la productivité prod uctivité en produit Productivité volumique horaire = (Pf (Pf - Po Po)) / durée totale P (g/L)
g de P / L / h
Pf
Po Temps
0
V, N, R, S
culture
t
(h)
ensemencement
Durée totale du process = V : vidange ; N : nettoyage ; R : remplissage ; S : stérilisation ; culture
Productivité horaire totale productivité horaire totale = ….
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse . 5. Cinétique du produit 6. Productivité
7. ‘Modes’ de culture 7.1 discontinu = batch
Batch Vf
milieu inoculum
Xo, So, Po
Vf Xo, So, Po
culture Vf Xo
Xf
So
Sf (0 en général)
Vf
Po
Pf
Xf, Sf, Pf
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse . 5. Cinétique du produit 6. Productivité
7. ‘Modes’ de culture 7.1 discontinu = batch
7.2 discontinu alimenté = fed-batch
Fed-batch Vf
remplissage partiel inoculum Vo Xo X culture
Vo Xo, So, Po
Po P Vo
alimentation Vo
Vf
X, S=0, P Vf
X Xf S~0 P Pf
Vo Xf, S=0, Pf
Alimentation en S débit constant
V Temps
palier
V Temps
variation continue du débit (en fonction de X par
V
ex.)
Temps
Influence du débit d’alimentation sur X
Intérêts du fed-batch évite inhibition par S diminue latence
meilleure productivité
permet changements de composition
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit 6. Productivité
7. ‘Modes’ de culture 7.1 discontinu = batch 7.2 discontinu alimenté = fed-batch
7.3 continu
continu Vf
milieu inoculum
Xo, So, Po
Vf Xo, So, Po
culture en batch Vf Xo
X
So
S (0 en général)
Vf
Po
P
X, S, P
alimentation + soutirage : V constant
Vf X, S, P
Mode batch
Mode continu
V constant = même débit entrée et sortie Débit d’entrée F (l/h) So
Débit de sortie F (l/h) X, S (≈ (≈0), P
Vf X, S, P
Temps de séjour = V / F Taux de dilution D = F / V
Jusqu’à... Production voulue Contamination Dérive de la souche microbienne Problème technique : colmatage...
Avantages productivité élevée pas d’inhibition S ou P
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit 6. Productivité
7. ‘Modes’ de culture 7.1 discontinu = batch 7.2 discontinu alimenté = fed-batch 7.3 continu
7.4 comparaison
Batch
Fed batch
Continu
Pompe d’alimentation
Pompe d’alimentation
Pompe de soutirage ou surverse
Plic !
Ploc !
FED BATCH
CONTINU CSTR
BATCH
P O U R
CONTRE U T I L I S A T I
O N S T Y P E S
-simple - souple d'utilisation - peu de problème d'inhibition par le P
FED-BATCH - productivité > batch - pas de problème d'inhibition par le S - contrôle possible du métabolisme par variation du S en cours d'alimentation - reste assez simple et souple
CONTINU
- productivité très élevée - fonctionne en continu - peu d’inhi d’inhibit bition ion S/P S/P
- productiv producti vité it é faible - inhibition possible par les - inhibition possible par le S P
- r squ sques e con con am na on ou de dérive de la souche - complexe à mettre en œuvre
- petites produ product ctions ions - process lents (fermentations alimentaires, biodégradation sur plusieurs - tout type de production jours…) industrielle - précultures pour bioréacteur industriel - S solides (dépollution des sols…)
- traitement d'un S en continu (STEP…) - manipulation de gros volumes à traiter ou à produire)
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse . 5. Cinétique du produit 6. Productivité 7. ‘Modes’ de culture
8. Méthodes de mesure de X, S et P
Vue d’ensemble / cas général Mesures in situ (si capteurs)
et/ou
Prélèvement
Mesure de S et P sur le surnageant
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse . 5. Cinétique du produit 6. Productivité 7. ‘Modes’ de culture
8. Méthodes de mesure de X, S et P 8.1 Mesure de la biomasse
Mesure du trouble absorbance à 500-650 nm • zon zone de liné linéar arit ité é ét étro roit ite e • rapide • eu coûteux
sonde turbidimétrique (capteur) • linéarité plus étendue • pa pas s de prél prélèv èvem emen entt à faire aire • en enrreg egis istr trem emen entt en cont contin inu u
Mesure directe de la biomasse microscopie (cellules eucaryotes) ufc matière sèche • • • •
prélever V mL coll collec ecte terr les micr microo-or orga gani nism smes es (filt (filtra rati tion on,, centr centri) i) laver le culot sécher → masse constante
Mesure d’une activité consommation d’O2 (capteur) production de CO2 (capteur)
CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse . 5. Cinétique du produit 6. Productivité 7. ‘Modes’ de culture
8. Méthodes de mesure de X, S et P 8.1 Mesure de la biomasse
8.2 Mesure de S et P
Mesure de S et P capteur quand disponible méthode chimique / biochimique sur surnageant de culture
Fin
Comparer
