CULTIVO BATCH
La conversión microbiológ microbiológica ica de carbohidrat carbohidratos os para obtener biomasa y productos productos de interés industrial es tema de constante actualidad debido a la creciente dependencia de los recursos renovables. Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la formulación de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de operación de las plantas industriales. El grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante determinante de la viabilidad viabilidad de un proceso proceso en gran escala. Desde este punto de vista, resulta de sumo interés poder llegar a determinar, estimar o predecir rendimientos que den cuenta de las transformaciones que se estn llevando a cabo en un biorreactor. Los balances de mater materia ia y ener energ! g!aa resu result ltan an a tal tal fin fin de suma suma util utilid idad ad y su empl empleo eo se ha e"te e"tend ndid ido o ampliamente en ciencias bsicas y aplicadas. La aparición en el mercado de sensores que permiten medir importantes variables de los cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los biorreactores #biorreactor $ recipiente en el cual se cultivan los microorganismos% han ampliado el horizonte para la apli aplica cació ción n de bala balanc nces es de mater materia ia y ener energ! g!a. a. la prod produc ucció ción n de biom biomasa asa #bio #bioma masa sa $ concentración de microorganismos e"presada en gramos de células secas & litro de cultivo%, consumo de las fuentes de ' y energ!a, de nitrógeno y ("!geno y las producción de '( ) y desprendimiento de calor son algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas e"perimentales y utilizadas en el planteo y clculo de balances de materia y energ!a. *ntes *ntes de proced proceder er a consid considerar erar el sistema sistema de anlisi anlisiss propue propuesto sto,, es conven convenien iente te introducir algunas definiciones y hacer ciertas consideraciones sobre algunas +regularidades observadas e"perimentalmente en el cultivo de microorganismos. En primer lugar se ha encontrado que la composición elemental de un importante n-me n-mero ro de micr microo oorg rgan anism ismos os,, culti cultiva vado doss bajo bajo difer diferen ente tess cond condic icio ione nes, s, se mant mantien ienee prcticamente constante as! podemos definir un +microorganismo promedio #composición standard% como aquel cuya composición es #/ p&p%0 ' $ 12,3 4 $ 2,51 6 $ 78,6 y 9 $ 86,:3, donde el apro"imadamente 3 / restante est representado por sales. Es importante recalcar que si bien la composición elemental promedio de la biomasa se mantiene prcticamente constante, constante, la concentración concentración intracelular intracelular de prote!nas, prote!nas, ;9* y dems constituyentes constituyentes celulares celulares puede variar sensiblemente entre diferentes especies e incluso entre diferentes estad!os del cultivo de un mismo microorganismo. mol de biomasa como la cantidad de biomasa que contiene 8 tomo gramo de '. *s! pues tenemos que0 8 ' > mol mol de biom biomas asa a $
8) + 8,=5 + 82" 6,3 + 81" 6,) 6,53
$ )3,: )3,: g
?ara ?ara cono conocer cer la cant cantid idad ad de biom biomasa asa que que corre corresp spon onde de a n '>mo '>mole less de biom biomasa asa debemos conocer su composición elemental y en base a dicha composición, el peso de 8 cmol. En términos generales la masa resulta ser0 n . ?cmol g de biomasa.
8
De forma anloga a como lo hicimos con la biomasa, podemos definir 8 '>mol de sustrato #entiéndase por sustrato fuente de carbono y energ!a, FCE%, 8 '>mol de fuente de 9, etc. 'omo ejemplo, para la glucosa0 ' 248)(2, 8 '>mol de glucosa estar representado por '4)( y pesar 76 g, y para el etanol, 8 '>mol de etanol #'4 7(6,3% pesar )7 g. (tro concepto que debemos introducir es el de +grado de reducción o +grado de reductancia, el cual ser de gran utilidad en el momento de plantear nuestros balances de materia y energ!a.
γ $ 1 γ $ : γ $ ) γ $ 1 γ $ 2
A
?odemos observar que los distintos valores de γ que figuran a la derecha de cada ecuación coinciden con el n-mero de +electrones disponibles que fueron transferidos desde el compuesto a o"idar al o"!geno. En general γ se e"presa en términos del n-mero de electrones disponibles & c>mol. ?ara calcular el valor de γ de un determinado compuesto se toman los grados de reducción 1 para el ' 8 para el 4 >) para el ( y >7 para el 9. En el caso del '( ), 4)( y 94 7 no se tienen e > disponibles #estados de referencia%, luego γ '() $ γ 4)( $ γ 947 $ 6. Be considera adems que el estado de o"idación predominante del 9 en la biomasa es >7. En términos generales para un compuesto de fórmula '4 a( b 9c, su grado de reducción vendr dado por0
γ $ 1 @ a > )b > 7c
#8%
Bi tenemos un compuesto cuya fórmula es ' h 4i ( j 9C , debemos llevarlo a la forma '4 i ( j 9 C h
h
h
Bi tomamos como ejemplo a nuestro m.o. promedio su biomasa% ser0 γ x
$ 1,85
γ " #donde el sub!ndice " indica
e > disp. ' > mol
Este valor, junto a ?cmol $ )3,: son dos de las +regularidades a las que nos hab!amos referido con anterioridad. Estos valores pueden ser empleados en balances de materia y energ!a en aquellos casos en que se desconoce la composición de la biomasa sin temor de incurrir en errores groseros de clculo. (tras regularidades observadas en el cultivo de m.o. es que el calor de reacción por mol de e > transferidos al () es relativamente constante para la o"idación de una amplia variedad de moléculas orgnicas y corresponde a )= cal&mol e > disponibles transferidos al (). Estamos ahora en condiciones de plantear una serie de balances de materia y energ!a, para lo cual trataremos al cultivo de un m.o. como si fuera una reacción qu!mica simple.
)
r $ velocidad de reaccion
→ 8Cmol S @a mol FN @b O)
+
y X X
y P prod @yCO
S
)
S
CO ) @w H )O @q #calor % S
Donde significa +biomasa, cualquiera sea su naturaleza. Debemos hacer notar que los coeficientes estequiométricos estn referidos a 8 '>mol de fuente de ' y energ!a. *s! pues0 y x s
C >mol de X C >mol de fte. de C y E
lo mismo para y p&s e y'()&s.
El balance de carbono para esta reacción de formación de biomasa y producto ser0
=8
yE @ y? @ y'( B
)
B
#)%
S
De igual forma podemos establecer un balance del grado de reducción0
γ s @ #>1%b $ y"&s . γ " @ y p&s . γ p ;eordenando y dividiendo por 1b γs
+
#7%
γ s obtenemos
y" . γ " s
γs
+
y p . γ p s
γ s
=8
#1%
o lo que es lo mismo
ε @ η @ ξ $ 8 donde
ε $ η $
1b γ s
#3%
#fracción de e> disponibles de la F'E transferidos al ( )%
y" .γ " s
#fracción de e> disp. de la F'E transferidos a la biomasa%
γ s
ξ $
y p .γ p s
#fracción de e> disp. de la F'E transferidos al producto%
γ s
Estos dos balances obedecen directamente al principio de conservación de la masa y la energ!a, en el primero de ellos, no puede haber entre los productos ms carbono del que un c> mol de sustrato puede aportar y el en el caso del segundo, los electrones disponibles del sustrato deben ir obligadamente a los distintos productos. Bi asumimos, como ya se mencionó, que el calor de reacción por mol de e > disponibles transferidos al o"!geno es constante para un importante n-mero de moléculas orgnicas, el primer término de la ecuación #1% nos da la fracción de energ!a del sustrato que evoluciona como calor. Bi llamamos q o a esa constante con q o $ )= cal&mol e> disponibles transferidos al (), el calor generado en la ecuación lG vendr dado por0
7
q $ 1 qo b Ccal&'>mol de sustrato
#2%
Bi conocemos la velocidad de consumo de ( ) de nuestro cultivo podemos calcular la velocidad de producción de calor y por lo tanto los requerimientos de 4 )( de enfriamiento para mantener constante la temperatura de nuestro biorreactor. El concepto de e > disponibles nos brinda un método simple de clculo para chequear los resultados obtenidos e"perimentalmente en lo que se da en llamar +anlisis de consistencia interna. Empleando las ecuaciones #)% y #1% o #3% con datos obtenidos en el laboratorio, podemos estimar parmetros no medidos y tener idea de cun confiables fueron nuestras determinaciones. Hedidas realizadas en el laboratorio deben encontrarse dentro de los intervalos0 6,51 ≤ y"&s @ y p&s @ y'()&B ≤ 8,62 6,57 ≤ η @ ε @ ξ ≤ 8,6= Ialores inferiores o superiores a estos l!mites de aceptabilidad determinados estad!sticamente ponen en evidencia errores en las determinaciones e"perimentales. En el trabajo habitual de laboratorio la cuantificación de la biomasa producida se efect-a gravimétricamente, es decir, se determina el incremento en biomasa e"presado en g&l #∆"% correspondiente a la utilización de una determinada cantidad de sustrato # ∆s% #igualmente e"presada en g&l% con lo cual definimos nuestro rendimiento en base a sustrato como ∆" J" = − al que tomamos como +rendimiento global en el que sólo se tienen en cuenta los s ∆s valores finales e iniciales de biomasa y sustrato, ms rigurosamente J "&s debiera ser e"presado d" por el l!mite ∆" & ∆s con ∆s → 6, esto es0 J" = − #observar que el signo negativo es s ds introducido porque " y s var!an en sentido contrario%. Estamos ahora en condiciones de calcular los valores de y"&s, y p&s, y y'()&B conociendo los respectivos rendimientos globales y los valores de ? cmol de , B, ? y '( ) tal cual vemos P cmol S P cmol S P cmol S yp = Y P y'( = J'( a continuación0 y" = J" S P cmol P s s P cmol X s B B PM CO) )
)
#=% ;esulta de gran interés conocer los destinos que toma la fuente de ' y energ!a durante el crecimiento microbiano y la fracción de la misma empleada por el m.o. para obtener la energ!a necesaria para llevar adelante sus funciones metabólicas. ?or balance de sustrato0 ∆s $ ∆s" @ ∆s p @ ∆sE
donde
#:%
∆B $ Bustrato total consumido ∆B" $ Fracción de sustrato utilizado en la formación de biomasa ∆B p $ Fracción de sustrato utilizado en la formación de producto ∆BE $ Fracción de sustrato utilizado para obtener energ!a
1
por consiguiente0
∆BE $ ∆B > ∆B" > ∆B p ∆BE $ ∆B @ ∆ ..
P cmol S
P cmol X
f E $ 8 > y"&s > y p&s $ y'(
)
B
+ ∆?.
P cmol S P cmol P
f E 0 fracc. de F'E destinada a la obtención de E
#88%
E"perimentalmente lo que se hace es determinar la producción global de '() y conociendo la masa de '( ) y sustrato consumido y calcular ∆BE por estequiometr!a. Este método presenta dos inconvenientes0 en primer lugar e"isten reacciones enzimticas que incorporan () a determinados componentes celulares #( ) que no es empleado para obtener energ!a% no obstante este consumo puede ser despreciado frente al global para o"idar la fte. de ' y E y el ms importante es que debemos suponer que γ " ≅ γ s, caso contrario se introduce un grosero error en el clculo.
'inética de crecimiento 4asta aqu! hemos visto las relaciones estequiométricas que e"isten en los cultivos microbianos, y cómo a través de ellas es posible obtener información del destino que tiene la fuente de carbono y energ!a. Las ecuaciones #)% y #1%, resumen toda la información que es posible obtener mediante los balances de materia y energ!a, pero nada dicen acerca de la velocidad, r, con que transcurre el proceso por lo que ahora centraremos la atención en este aspecto. 'onvendr antes definir la forma en que e"presaremos las distintas velocidades. De este modo llamaremos a0 d"
r " $
dt
. velocidad
las unidades sern0
de crecimiento microbiano #o, brevemente, velocidad de crecimiento% y
'mol biomasa L.h
del mismo modo0 r s $
−
r p $
r (
)
=
'mol F'E $ velocidad de consumo de sustrato L . h
ds dt
'mol de producto $ velocidad de formación de producto. L.h
dp dt
−d (
)
dt
mol ( ) $ velocidad de consumo de ( ) L . h
3
r '(
)
=
d '(
)
dt
mol '() $ velocidad de producción de '( ) L . h
Estas velocidades también pueden ser e"presadas en
g L.h
y en este caso, para diferenciarlo
del anterior, las denotaremos con ;. ?or ej.0 ; " $
d" dt
gramos de biomasa L.h
*nlogamente tendremos0 ; s, ; ( ) , etc. La conversión entre r " y ; " estar dada por0 ; " $ )3,: . r " *nlogamente0 ; s $
g de B c mol de B
. r s
; () = 7). . r ( ) , etc. Ielocidades espec!ficas0 'orresponden alas anteriormente definidas pero referidas a la unidad de biomasa, es decir0 r " $ µ velocidad espec!fica de crecimiento. " r s "
$ qs velocidad espec!fica de consumo de sustrato #s puede ser la fuente de carbono y energ!a o cualquier otro componente del medio%
r ( ) " r p "
= q ( velocidad espec!fica de consumo de ( ). )
= q p velocidad espec!fica de formación de producto. etc.
Las velocidades espec!ficas suelen brindar información acerca de cul es la actividad metabólica del microorganismo #o de la biomasa% durante el cultivo, ya que el estar referidos a la unidad de biomasa cualquier modificación en el valor de µ, qs, etc. estar indicando que KalgoK est ocurriendo en el metabolismo del microorganismo en cuestión.
2
De hecho es frecuente que las velocidades espec!ficas var!en durante el cultivo, y es muy com-n que por ej. el valor de µ al principio del cultivo difiera del que se encuentra en estadios posteriores. Lo mismo vale para q s, q () , etc. 'urva de crecimiento 'uando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, estos comienzan a multiplicarse a e"pensas de los nutrientes hasta que, finalmente, el crecimiento se detiene por agotamiento de alguno de los componentes del medio de cultivo #sustrato limitante% o bien por acumulación de inhibidores. n cultivo de esta naturaleza, en el cual una cierta cantidad de microorganismos es sembrada en un volumen dado de medio de cultivo, se conoce como 'ultivo en batch, su empleo es muy frecuente peso no es el -nico, ya que e"isten otros métodos para cultivar microorganismos, por ej. el Match alimentado y el 'ultivo continuo. 'ultivo en Match La evolución del cultivo en el tiempo, sigue una curva t!pica la cual recibe el nombre de +curva de crecimiento en batch. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden separarse en cuatro fases perfectamente diferenciables. En primer lugar e"iste una fase donde prcticamente no hay división celular pero s! aumento de la masa individual de los microorganismos #fase +lag o fase de retardo%. Le sigue una etapa donde el crecimiento ocurre a velocidad espec!fica #µ% m"ima y constante $ µm #fase e"ponencial%. *l final de esta fase se alcanza la m"ima concentración microbiana. ?osteriormente hay un rpido per!odo de desaceleración donde µ → 6 y se entra en la fase estacionaria la cual es causada por agotamiento de alg-n nutriente #el sustrato limitante% o bien por acumulación de inhibidores. Durante esta fase la concentración microbiana #o de biomasa% permanece constante. Finalmente se llega a una -ltima etapa donde la concentración de biomasa disminuye por autolisis o como consecuencia del metabolismo endógeno #fase de decaimiento%. La duración de cada una de estas fases es función del microorganismo en estudio y de la composición del medio de cultivo. En particular la fase lag depende adems de la fase de crecimiento en que se encuentran las células en el momento de ser sembradas y de la composición del medio de cultivo en que fueron crecidas. Bi éste es igual a la composición del medio en que se van a sembrar y las células estn en fase e"ponencial, la duración de la fase lag, en general se acorta y puede llegar a desaparecer, lo cual es deseable ya que constituye tiempo perdido. La descripción matemtica #modelado% de las cuatro fases descriptas es sumamente compleja y escapa a los fines de esta gu!a, por lo que sólo veremos una ms simple que sólo contempla la fase e"ponencial y la estacionaria. De la definición de µ obtenemos r " $ µ . "
#8)%
donde " $ concentración de biomasa. 4emos visto que µ var!a durante el cultivo, siendo un valor constante y m"imo en la fase e"ponencial # µm% y nulo en la estacionaria. Honod ha propuesto una relación muy simple entre el valor de µ y la concentración de sustrato limitante, B, entendiéndose por éste al componente del medio de cultivo que esté en menor proporción
=
respecto de las necesidades del microorganismo. ?or tanto B puede ser la fuente de 9, de ', alg-n aminocido, etc. La ecuación es0
µ $ µm
B
#87%
DB + B
* B se la conoce como 'onstante de Baturación, y da una idea de la afinidad que tiene el microorganismo por el sustrato en cuestión. * menor B mayor afinidad. 9ormalmente B tiene valores muy pequeNos #86 >) > 86>7 g&l% por lo que concentraciones relativamente pequeNas de B son suficientes para hacer que0
µ $ µm
#81%
;eemplazando la ec. #87% en #8)% queda0 r " $ µm
B
. "
DB + B
#83%
*l principio del cultivo todos los nutrientes estarn en e"ceso, y en particular el sustrato limitante también, por lo que la e". #83% se reduce a #fase e"ponencial% r " $ µm " o bien0
d" dt
$ µm . "
#82%
La ec. #82% es fcilmente integrable y si hacemos a t $ 6 " $ " o #concentración inicial de microorganismos% queda0 ln " $ ln " o @ µm t
#8=%
" $ "o eµm t
#8:%
o bien
?or tanto en esta fase la concentración de biomasa aumenta e"ponencialmente, y también lo hace r " ya que reemplazando0 r " $ µm "o e µm t * partir de la ec. #8=% se puede calcular el tiempo de generación del microorganismo #per!odo de tiempo en que la biomasa se duplica% haciendo " $ ) " o y nos queda tg $
ln ) µ m
* medida que transcurre el tiempo de cultivo, B va disminuyendo #y por tanto r "% hasta que finalmente B $ 6 #fase estacionaria%, y r " $ 6
#85%
lo que implica0 " $ cte $ "f
#)6%
:
"f $ concentración final de biomasa. Bi graficamos ln " vs. t se obtiene un grfico como el de la fig.
De la fase e"ponencial se calcula µm mediante la ecuación #8=%. La duración de la fase lag, tL, se puede calcular del grfico, o bien haciendo una corrección en la ec. #8=%. ln " $ ln " o @ µm #t > tL% Bi tomamos un valor cualquiera de " que corresponda a la fase e"ponencial, " e, podemos calcular tL. l " ln e tL $ te > µ m "o
'onsumo de Bustrato 4emos visto que el rendimiento se defin!a como y " $ >
d" ds
por tanto r s $
r "
#))%
y"
reemplazando en la ec. #))% la ec. #83% queda0
5
=−
d" & dt ds& dt
=
r " rs
=
µ
qs
r s $
µ m
y"
.
B CB + B
. "
#)7%
* medida que B tiende a cero, r s también. En fase e"ponencial ser B>> C s y adems " estar dado por la ec. #8:%, por tanto0
−
ds
=
µ t m
µ m " o e
dt
#)1%
y"
Bi a t $ 6 es B $ B o implica0 B $ Bo >
"o y"
(e
µ t m
)
−8
#)3%
La ec. #)3% da la variación de B en función de t durante la fase e"ponencial. Bi se conoce de antemano el rendimiento y " #o J"% y las concentraciones iniciales de sustrato y biomasa, es fcil estimar el valor de "f ya que0
∆" $ >J" . ∆B
#)2%
" > "o $ J" #B > B o%
#)=%
Bi B es el sustrato limitante, se tendr que para " $ " f ser Bf $ 6, por tanto0 "f $ "o @ J". Bo
#):%
La ec. #)=% permite calcular B para un " dado #o viceversa% en cualquier parte de la curva de crecimiento, siempre y cuando J" #o y"% se mantenga constante. *lternativamente la ec. #)=% puede emplearse para verificar si tal supuesto se cumple ya que la grfica de #" > "o% en función de #B o > B% deber ajustarse a una recta. De todos modos siempre es posible calcular un rendimiento global, independientemente de las variaciones que pueda tener durante el cultivo, empleando sólo valores iniciales y finales0
( "f − "o ) J"&s $ > ( Bf − Bo )
#)5%
'onsumo de ( ) 4emos visto que realizando un balance entre la composición de los gases que ingresan y salen del biorreactor se puede calcular r ( ) . 'on este valor y el de la concentración de biomasa, ", se puede calcular a distintos tiempos el valor de q ( ) =
r ()
, con lo cual tendremos " una idea de lo que ocurre con la capacidad respiratoria de los microorganismos durante el cultivo. *l respecto es -til estudiar cules son las posibles causas de variación de q () .
86
8% Bea y"&o $
∆" t
∫
o
r( ) dt
#76%
y"&o $ rendimiento de biomasa base a ( ) consumido
*l igual que en la ec. #)8% podemos hacer0
y"&o $
r " r( )
=
µ
q ()
#78%
de donde reemplazando µ por la ec. #87% q () =
B
µ m
y "& o C s + B
#7)%
En fase e"ponencial es B>> C s y ∴
q () =
µ m
y "& o
= q(
)m
#77%
es decir que en esta fase q ( ) se mantiene constante y con un valor m"imo. * medida que B disminuye, q ( ) también hasta que virtualmente se hace nulo en la fase estacionaria. Esto es particularmente vlido cuando el sustrato limitante es la fuente de carbono y energ!a, ya que al agotarse ésta, los microorganismos se quedan sin +combustible y por tanto el consumo de () cesa. 9o ocurre lo mismo cuando el sustrato limitante es por ej. la fuente de nitrógeno, pues si bien cuando ésta se agote se detendr el crecimiento, nada impide que los microorganismos sigan respirando ya que cuentan con +combustible en e"ceso. )% (tra causa que afecta el valor de q ( ) es la concentración de ( ) disuelto. ?or analog!a con la ecuación de Honod, se ha propuesto la ecuación0 q () = q () m
' Co + '
#71%
donde ' $ concentración de ( s disuelto. *l igual que C s, se encuentra que C o es pequeNo, y en general valores de ' del orden de 6,: mg&l #86/ de saturación% son normalmente suficientes para que q ( ) $ q ( ) m. * la concentración de ( ) disuelto por encima de la cual el valor de q ( ) se mantiene constante, se la conoce como concentración cr!tica #'c%.
?*;
88
Hedio de cultivo0 Plucosa ..............................................................................86,66 g&l rea ................................................................................... 8,36 g&l )4?(1 ............................................................................. 8,66 g&l HgB(1.=4)( ..................................................................... 6,26 g&l 'a'l).)4)( ........................................................................ 6,86 g&l cido c!trico ........................................................................ 6,13 g&l 47M(7 ................................................................................. 6,86 mg&l 'uB(1 ................................................................................. 6,86 mg&l O ........................................................................................ 6,86 mg&l Fe'l7 ................................................................................... 6,86 mg&l 9a)Ho(1 ............................................................................. 6,86 mg&l inositol ................................................................................. 2,66 µg&l biotina .................................................................................. 2,66 µg&l acido fólico .......................................................................... 2,66 µg&l pantotenato de calcio ............................................................ 6,:6 mg&l tiamina .................................................................................. 6,:6 mg&l cido nicot!nico ..................................................................... 6,:6 mg&l cido p>amino benzoico ......................................................... 6,16 mg&l riboflavina ............................................................................. 6,16 mg&l pirido"ina .............................................................................. 8,26 mg&l antiespumante ....................................................................... 7 gotas p4 3,36 #ajustado con 4'l o 4)B(1 89% Iolumen de cultivo0 7,6 l Los fosfatos se esterilizan por calor h-medo #autoclave%, fraccionados en un erlenmeyer con salida lateral, disolviendo la cantidad necesaria para preparar ),= l de medio de cultivo, en 366 ml de 4 )( y se ajusta el p4 en 3,36. El resto de los componentes #e"cepto la urea y la solución de vitaminas% se disuelven en ),) l. de 4 )( y se ajusta el p4 en 3,36. El resto de los componentes #e"cepto la urea y la solución de vitaminas% se disuelven en ),) l. de 4)(, los microelementos se agregan en solución concentrada 8666 veces a razón de 8 ml&l, se ajusta el p4 en 3,36 y se esterilizan, en autoclave, en el biorreactor. El tiempo de esterilización ser en ambos casos de 83 minutos. La urea se esteriliza por filtración. Be prepara una solución madre con 366 g&l de urea y se esteriliza con membrana absoluta. Esta solución se adiciona en proporción de 2,6> ml por litro de medio de cultivo. Las vitaminas se preparan en solución concentrada 8666 veces, se esterilizan por filtración y se adicionan a razon de 8 ml&l de medio. Onóculo0
8)
provenientes de un cultivo en agar inclinado. Las mismas se resuspenden fcilmente en agua. La temperatura de incubación ser en todos los casos de 76 °'. ?;('EDOHOE9<(0 8.> 'onectar el sistema de aireación al filtro estéril del biorreactor. 7.> 'onectar el sistema de agitación del biorreactor. Fijar la agitación en 266 rpm. 1.> *dicionar en forma estéril los fosfatos, la urea y las vitaminas al resto del medio de cultivo contenido en el biorreactor. 3.> 'alibrar el electrodo para medir ( ) disuelto haciendo pasar por el biorreactor, primero una corriente de nitrógeno y ajustando la lectura a 6/ de saturación #ajuste del cero% y luego aire a un caudal de ) l&min., ajustando con la perilla de calibración a 866/ de saturación. En ambos casos, antes de realizar los ajustes, se debe dejar transcurrir 86 a 83 minutos. Los gases que ingresen al biorreactor debern pasar por el filtro estéril. 2.> 'alibrar los instrumentos de medida para efectuar el anlisis de los gases a la salida del biorreactor #analizador de () y de '( )%. =.> Bembrar el biorreactor y aguardar ) a 7 minutos 5.> Hedir el porcentaje de () y '() en lo gases de salida del biorreactor
*nlisis de las muestras 88.> 86 mL se centrifugan 86 minutos. Puardar el sobrenadante para determinar concentración de F'E y producto. Lavar #una vez% con agua destilada el pellet de levaduras, centrifugar, resuspender las células con ms agua destilada y hacer peso seco a 863Q'. 8).> *l resto de la muestra medirle0 8).8.> p4 8).).> D( a 2)6. La muestra deber diluirse de forma tal de obtener lecturas entre 6,8 y 6,2. 8).7.> 'ontrol de contaminación por observación microscópica. 87.> ;epetir los pasos 5 a 8) cada hora. 81.> Finalizado el cultivo, medir el volumen remanente. 'on este dato y los de volumen de muestra y lavado calcular el volumen de cultivo a la hora 'E;(, 8 ), 7 etc. El volumen obtenido en cada caso ser el utilizado para el clculo de r O) y r CO) a los correspondientes tiempos.
;esultados Los datos se volcarn en una tabla del siguiente formato y luego se harn las graficas correspondientes en función del tiempo
87
4ora
<
p4
D(2)6
B
r O
)
r CO
)
'.;.
O.> Praficar ln " vs. t. y D( vs. t. 'alcular R ma" . OO.>8 Ierificar si J se mantuvo constante durante el cultivo. OO>) 'alcular J e y globales. OO>7 'alcular el consumo global de ( ) y el '( ) total producido. 'on estos valores calcular b e y'() respectivamente. OOO> Ierificar si se cumplen los balances de carbono y de grado de reducción.
ε @ η @ ξ $ 8 y" @ y'() $ 8
81
