CURVA CURVA DE TITULACIÓN TITULA CIÓN DE AMINOACIDOS Y SEPARACIÓN SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA TITRATION CURVE OF AMINO ACIDS AND AMINO ACIDS SEPARATION THIN LAYER CHROMATOGRAPHY Guzmán C, C.
Corporación tecnológica de Bogotá. Tecnología Tecnología en química industrial Bogotá, Colombia 10/09/201
RESUMEN
La curva de titulación titulación de un aminoácido aminoácido se da por una titulación potenciométrica de un aminoácido partiendo de un pH muy acido hasta un pH muy básico, aumentando el pH por el constante aumento de iones OH provenientes del agente titulante, en este cas caso NaO aOH H. El pH de inic inicio io para para la titulación de la glicina es de ,!" y se debe llevar hasta un pH de #," donde se deben ir tomando valores de pH cada ",!ml de NaOH. La crom cromat atog ogra ra$% $%aa en capa capa $ina $ina es una una técn técnic icaa anal anal%t %tic icaa util utili& i&ad adaa para para sepa separa rar r moléculas moléculas relativamen relativamente te pe'ue(as. pe'ue(as. En esta práctica se utili&ó esta técnica para anali&ar aminoácidos como) Lisina, ácido glutámico, *enilalanina, glicina, además de esto estoss amin aminoá oáci cido doss tambi también én se anal anali& i&óó aspartame en agua y en HNO+ y una bebida comerc comercial ial para para reali&a reali&arr este este proces proceso, o, se tra&ó una l%nea de ! mm a lo ancho de la placa medidos desde su base, posteriormente se sembraron las di$erentes muestras, luego de esto se colocó la placa en la cámara cromatográ$ica hasta 'ue la $ase móvil recorrió está a ! mm del borde superior, la placa se sacó se deó secar sobre una plancha de calentamiento y sobre ella se agregó ninhidrina ".# el cual $unciona como agente revelador para lograr calcular calcular cada /$ respecto a cada una de las marcas. 0eg1n los resultados obtenidos se hace una comparación entre los $actores de retención e2pe e2peri rim menta entale less con con los los teór teóric icos os y se obse observ rvaa una una vari variac ació iónn sign signi$ i$ic icat ativ iva, a, atribuida a $actores como el tiempo 'ue
permaneció la placa en la cámara y a la $ase móvil utili&ada. 3alabras clave) 4itulación potenciométrica, crom cromato atogr gra$ a$%a %a,, amin aminoá oáci cido dos, s, $acto $actorr de retención, $ase móvil, $ase estacionaria. ABSTRACT
4he ti 4he titr trat atio ionn cu curv rvee o$ an am amin inoo ac acid id is given by a potentiometric titration o$ an amino acid starting $rom a very acidic pH to a very basic pH, increasing the pH by the steady increase in OH- ions $rom the titrant, in this case NaOH. 4he pH titration start $or glycine is .!" and should lead to a pH o$ #." 5here they should be ta6ing pH values every ".! ml NaOH. 4he th 4he thin in la layyer ch chro rom mat atog ogra raph phyy is an anal an alyyti tica call te tech chni ni'u 'uee us used ed to se sepa para rate te relatively small molecules. 4his techni'ue is used in practice to analy&e amino acids such as lysine, glutamic acid, phenylalanine, glycine, aspartame plus these amino acids 5as also tested in 5ater and HNO+ and a commercial beverage $or this process, a line o$ ! mm 5as dra5n across the 5idth o$ the measured plate $rom the ground, then the di$$erent samples, a$ter this the plate 5as placed on the chromatographic chamber until the mobile phase toured planted is ! mm o$ the top, the t he plate 5as removed allo5ed to dry on a hot plate and ".# ninhydrin on it 5hich $unctions as developing agent to achieve calculate each /$ respect to each o$ the mar6s are added. 7ccording to the results a comparison comp arison bet5e bet5een en e2per e2perimenta imentall $acto $actors rs 5ith the theoretical retention is made and signi$ican signi $icantt varia variation, tion, attrib attributed uted to $actor $actorss
such as the time he spent in the chamber plate and the mobile phase used is observed. 8ey5ords) potentiometric titration, chromatography, amino acids, retention $actor, the mobile phase, stationary phase.
prote%nas y la caracteri&ación de aminoácidos, por lo cual se desarrolló esta técnica para la práctica reali&ada en el laboratorio.
INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
Las titulaciones potenciométricas son métodos donde el punto $inal no se puede determinar, por ello se emplean instrumentos como el pH-metro el cual ayudara a llegar al l%mite má2imo de pH al 'ue debe llegar el analito. Este tipo de métodos son muy e2actos y a esto se debe su alta aplicabilidad. 9ichas titulaciones pueden darse de dos modos ácido : base y base : ácido. La cromatogra$%a ha sido utili&ada como herramienta en la separación de especies 'u%micas estrechamente relacionadas en me&clas compleas, este método de separación tiene di$erentes técnicas 'ue var%an dependiendo de la me&cla 'ue se posea si son gases o l%'uidos. 3ara este caso en particular se utili&ó la técnica de cromatogra$%a en capa $ina 'ue básicamente permite comparar muestras y reali&ar el seguimiento de la reacción. Esta se basa en separar componentes por di$erencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. El movimiento de las moléculas a lo largo del sistema es el resultado del e'uilibrio entre las $uer&as eercidas por la $ase móvil ;transmisión o arrastre< a lo largo de su despla&amiento sobre la $ase estacionaria. ;=orr%n Novo > 7bril 9%a&, s$< Las me&clas de aminoácidos pueden separarse utili&ando esta técnica cromatográ$ica siendo su $ase móvil ?utanol) agua) ácido acético y utili&ando una solución reveladora de ninhidrina. Los aminoácidos aparecen como manchas p1rpuras sobre un $ondo tenuemente amarillo. 7minoácidos 'ue tengan un carácter apolar, tendrán la tendencia de despla&arse unto con la $ase móvil, mientras 'ue los aminoácidos polares serán retenidos por la $ase estacionaria. ;@utiérre& Aenegas, s$< Este método es muy utili&ado para determinar la composición de algunas
Materiales •
•
•
•
•
•
•
•
•
Bapilar Es un tubo de vidrio de diámetro muy pe'ue(o y corta longitud. 4ubos de ensayo *orma parte del material de vidrio de un laboratorio 'u%mico. Este instrumento permite la preparación de soluciones. 3laca de s%lica Bapa delgada de un adsorbente ;como por eemplo gel de s%lice, al1mina o celulosa< depositada sobre un soporte plano como una placa de vidrio, una lámina de aluminio o de plástico. 3ipeta a$orada de ! mL 3ermiten la trans$erencia de un volumen generalmente no mayor a #" ml de un recipiente a otro de $orma e2acta. Bámara Bromatográ$ica /ecipiente 'ue contiene la $ase móvil o l%'uida. Aasos de precipitado de !" mL /ecipientes de vidrio aun'ue pueden ser metálicos o de plástico, son cil%ndricos con un $ondo plano y sirven para preparar o calentar sustancias y traspasar l%'uidos. Aidrio de relo Es una lámina de vidrio en $orma circular cóncava-conve2a. 0e utili&a para evaporar l%'uidos, pesar productos sólidos o como cubierta de vasos de precipitados, y contener sustancias parcialmente corrosivas ?ureta #!ml) 0e utili&a para reali&ar titulaciones de todo tipo, en esta va el agente titulante, el cual puede ser ácido o base. 3lancha de calentamiento Es un pe'ue(o aparato de sobremesa, portátil y autónomo, 'ue posee uno o más elementos de cale$acción eléctrica, y 'ue se emplea para calentar
recipientes con l%'uidos, de $orma controlada. Métodos
0e empleó el método de una titulación potenciométrica, donde el analito era el aminoácido glicina al cual se le da un carácter ácido por medio de HNO+ +C, donde el analito deb%a tener un pH de ,!". Bomo agente titulante se utili&ó 8OH ",#!C el cual se iba agregando de a ",!ml y tomar la medida de pH respectiva, estos valores $ueron medidos al utili&ar un pHmetro calibrado, donde la titulación se llevaba hasta llegar a un pH de #. 0e utili&ó el método o técnica de cromatogra$%a de capa $ina en el 'ue la $ase
móvil $ue butanol) ácido acético) agua. 0obre la placa se tra&ó una l%nea de ! mm respecto a la base y en ella se sembraron los di$erentes aminoácidos. 3osteriormente esta placa se introduo dentro de la cámara cromatográ$ica y se deó all% hasta 'ue la $ase móvil recorrió la placa hasta apro2imadamente ! mm de la parte superior de esta. 7 continuación la placa se deó secar sobre la plancha de calentamiento hasta 'ue desapareció la humedad de la placa, luego de esto se adicionó ninhidrina 'ue reveló las manchas en la placa. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Curva de titulació Glicia 14 12 10
8a NH+D ,I
8 6 4
p8a BOOH D #,+F
2 0 0
2
4
6
8
10
12
14
!rá"ica 1. Cur#a de titulación !licina
7 pH ácido la glicina se encuentra como ácido diprotico, esto está dado por 'ue el N terminal y el grupo carbo2ilo están totalmente protonados. 7l momento de agregar OH- el grupo carbo2ilo pasa a ser carbo2ilato donde el pH D p8, lo 'ue nos indica 'ue en esta parte de la curva de titulación se $orme una &ona bu$$er o amortiguadora, donde en esta &ona no se generan cambios de pH apreciables. En esta parte la glicina está en un !" como catión y el otro !" como &5itterion. La glicina al tener un rango de pH entre #,F y +,#G se dispara y vuelve a tener una &ona constante a un pH de ,#, 'ue es cuando el NH + terminal se desprotona y da la $ormación de NH#, dando lugar a una &ona amortiguadora y a 'ue la glicina este en !" como
&5itterion y el otro !" como anión. Babe resaltar 'ue en la mitad de estas dos &onas amortiguadoras se da el punto isoeléctrico el cual se calcula de la siguiente manera) pI =
2,34 + 9,69 2
=
6,015
9icho punto isoeléctrico es cuando la molecula del aminoácido en este caso la glicina presenta una carga eléctrica neutra o igual a ". La separación de los aminoácidos por cromatogra$%a de capa $ina, implica 'ue los 'ue tengan un carácter más apolar, tendrán tendencia a despla&arse con la $ase móvil, mientras 'ue los aminoácidos 'ue sean polares, serán retenidos por la $ase
estacionaria la $ase móvil utili&ada en el desarrollo de la práctica ;butanol) ácido acético) agua< es apolar debido a 'ue está $ormada por solventes 'ue son más apolares 'ue el agua. La separación de los aminoácidos se pudo
estructuras de los aminoácidos, nos ayudan a determinar la polaridad de la molécula y as% poder determinar la separación en la placa. 3odemos determinar 'ue la $enilalanina es un aminoácido apolar, aminoácidos como la glicina ;sin carga<, ácido glutámico y lisina ;con carga< son moléculas polares. 0eg1n el resultado obtenido en la placa se puede decir 'ue los aminoácidos polares tienen mayor interacción con la $ase móvil debido a su carácter polar, es por esto 'ue el ácido glutámico $ue el 'ue tuvo mayor $actor de retención. Bon respecto a la segunda placa de silica donde se sembraron $enilalanina, aspartame en agua, aspartame en HNO+ y Boca Bola light.
observar en la $igura , debido a la aparición de manchas de color a&ul-violeta. 7demás de la aparición de dos manchas una de color narana y otra roa. La sustancia 'ue revela la posición del aminoácido es la ninhidrina se utili&a debido a 'ue ayuda a determinar aminoácidos con el grupo amino libre. @licina Jcido @lutámico *enilalanina Lisina 4otal K
",+G ",I! ",IF ",FG F,# cm
Tabla 2. $" de los aminoácidos
0in embargo aun'ue en la $igura podemos observar la presencia de aminoácidos, también se puede observar en la tabla 'ue todos los aminoácidos tuvieron movimiento, donde el ácido glutámico presenta mayor $actor de retención. 7l reali&ar una comparación entre los $actores de retención e2perimentales con los teóricos se observa una variación signi$icativa con respecto a los cálculos reali&ados en la placa, ya 'ue el ácido glutámico, presentan un /$ de ".G!. La variación en los valores de /$ puede estar dado por el tiempo de duración dentro de la cámara cromatográ$ica, la $ase móvil y el volumen de esta. El reparto de los aminoácidos en el papel se debe a su naturale&a 'u%mica. Las
*enilalanina 7spartame en agua 7spartame en HNO+ Boca Bola light 4otal K
", ",+# ",F ",+ F,"
Tabla 2. $" de los aminoácidos
Bon respecto a la tabla # se puede identi$icar 'ue la $enilalanina $ue el aminoácido 'ue tuvo un $actor de retención mayor lo 'ue 'uiere decir 'ue tuvo mayor despla&amiento sobre la placa de silica. Esta placa duro más tiempo en la cámara cromatográ$ica, donde se evidencio 'ue la $ase móvil tardo mucho en llegar al l%mite superior de la placa. CONCLUSIONES
7l obtener la curva de titulación de la glicina se logra identi$icar dos &onas amortiguadoras, las cuales están dadas a la igualdad entre el pH y p8 tanto del grupo carbo2ilo y el NH+ terminal. El punto isoeléctrico de la glicina puede determinarse tomando los valores teóricos o los promedios de cada &ona amortiguadora, donde la di$erencia entre los dos valores obtenidos va a ser relativamente m%nima. Babe resaltar 'ue si el pH aumenta de ,I la glicina se va a encontrar a su totalidad como anión, ya 'ue su carga es - dado por la disociación del NH+ terminal.
=orr%n Novo, =., > 7bril 9%a&, C. N. ;s$<. El $actor de retención depende directamente de la relación 'ue tenga cada aminoácido con el solvente o $ase móvil, lo 'ue $ue se puede evidenciar en la 4abla además a partir de esto se puede determinar la polaridad 'ue estos tengan, partiendo de conocer la polaridad del solvente, en este caso polar. Bon esta técnica se puede determinar cualitativamente la composición de una muestra corriéndola unto a estándares de re$erencia, en este caso siendo la muestra la bebida comercial ;Boca Bola light< y los estándares los aminoácidos utili&ados. La muestra de bebida comercial presento una movilidad corta en la placa ya 'ue presento mayor a$inidad con la $ase estacionaria, debido a 'ue está compuesta por aminoácidos apolares. El aminoácido con mayor movilidad en la placa $ue el ácido glutámico de la placa n1mero con un $actor de retención de ",I! debido a 'ue es una molécula polar, por lo tanto tiene más a$inidad con la $ase móvil. BIBLIOGRAFÍA
Lehninger principios de bio'u%micaM. Nelson, 9avid L., Cichael C. Bo2.
%ni#ersidad Católica de oriente.
/ecuperado el ! de 0eptiembre de #"!, de 0eparación de aminoácidos por cromatogra$%a) http)555.uco.esdptosbio'uimic a-biolmolpd$s#"B/OC74O@/7* B+G97#"9E#"B737 #"*N7#"9E#"77s.pd$ 3einado, =., > 4obirio Celénde&, *. ;#"F<. %ni#ersidad católica de oriente.
/ecuperado el I de septiembre de #"!, de Bromatogra$%a en papel de aminoácidos ) http)555.uco.esdptosbio'uimic a-biolmolpd$s"#"B/OC74O@/7* B+G97#"373EL #"77s.pd$
