UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK n -HEKSAN, -HEKSAN, ETIL ASETAT, DAN ETANOL 70 % DAUN ROSELLA (Hibiscus ( Hibiscus sabdariffa L.) sabdariffa L.) TERHADAP Staphylococcus aureus ATCC aureus ATCC 25923 ANTIBACTERIAL ANTIBACTERIAL ACTIVITY TEST EXTRACT n -HEXANE, -HEXANE, ETHYL ACETATE AND ETHANOL 70 % ROSELLA LEAF (Hibiscus (Hibiscus sabdariffa L.) sabdariffa L.) AGAINST Staphylococcus aureus ATCC aureus ATCC 25923 Ratna Agung Samsumaharto 1; Yustina Erlina Nur Indah Sari 2 1 Fakultas Ilmu Kesehatan; Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi Surakarta Jl. Let. Jend. Sutoyo, Mojosongo, Surakarta 57127
ABSTRAK Daun Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) merupakan bahan obat tradisional yang telah digunakan oleh masyarakat diantaranya sebagai antibakteri, mengobati kaki pecah-pecah, luka bakar ringan, dan penyakit kulit seperti bisul. Daun Rosella mengandung saponin, flavonoida, dan polifenol. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak n-heksan, etil asetat dan etanol 70 % dari daun Rosella yang paling efektif terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923. Ekstraksi dimulai dari pelarut n-heksan, ampas dari n-heksan diekstraksi kembali dengan etil asetat diekstraksi lagi dengan etanol 70 % masing-masing ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan penangas air kemudian digunakan untuk uji antibakteri menggunakan metode dilusi dan metode difusi. Metode dilusi dengan pengenceran 12 tabung menggunakan media VJA. Konsentrasi ekstrak yang digunakan digunakan yaitu 100 % (b/v); 50 % (b/v); 25 % (b/v); 12,5 % (b/v); 6,25 % (b/v); 3,13 % (b/v); 1,57 % (b/v); 0,79 % (b/v); 0,39 % (b/v); 0,197 % (b/v), kontrol (-); kontrol (+), kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Hasil pengenceran tiap-tiap tabung diinokulasi pada media VJA dengan cara digores. Metode difusi dilakukan dengan cara dibuat sumuran berdiameter 9 mm, kemudian ditetesi dengan ekstrak n-heksan, etil asetat dan etanol 70 % dengan konsentrasi 25 %; 50 %; 75 %; 100 %; dan blanko masing-masing sebanyak 50µl, kemudian diukur diameter hambatnya. Hasil percobaan uji aktivitas antibakteri Staphylococcus aureus esktrak etil asetat memiliki KBM 25 % (b/v); 50 % (b/v); 100 % (b/v), ekstrak etanol 70 % memiliki KBM 50% (b/v); 100% (b/v). Sedangkan ekstrak n-heksan tidak memberikan KBM. Hasil penelitian metode difusi memberikan luas daerah hambatan rata-rata pada ekstrak etil asetat 7,67 mm (25 %); 11,33 mm (50 %); 20,33 mm (75 %); 26,67 mm (100 %), ekstrak etanol 70 % memberikan luas daerah hambatan 8,33 mm (50 %); 11 mm (75 %); 16 mm (100 %). Sedangkan ekstrak n-heksan tidak memberikan daerah hambatan. Sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak etil asetat lebih efektif sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dibanding dengan ekstrak n-heksan dan etanol 70 %. Kata kunci : Hibiscus : Hibiscus sabdariffa L., ekstrak n-heksan, ekstrak etil asetat, ekstrak etanol 70 %, Staphylococcus Staphylococcus aureus, antibakteri.
ABSTRACT Rosella leaf (Hibiscus sabdariffa L.) is a traditional medicine that has been used by society such as antibacterial, treat broken legs, minor burns, and skin diseases like boils. Rosella leaves contain saponin, flavonoida, and polyphenols. This study aims to determine the antibacterial activity n- hexane extracts, ethyl acetate and ethanol 70 % of the Rosella leaf that is the most effective against Staphylococcus aureus ATCC 25923. Starting from the solvent extraction of n-hexane, n- hexane from the residue was extracted again with ethyl acetate extracted again with ethanol 70 % of each extract obtained was concentrated by a water bath and then used for antibacterial tests using dilution and diffusion methods. Dilution method with the 12 tubes dilution using VJA media. Extract concentration used is 100 % (b/v); 50 % (b/v); 25 % (b/v); 12.5 % (b/v); 6.25 % (b/v); 3.13 % (b/v); 1.57 % (b/v); 0.79 % (b/v); 0.39 % (b/v); 0.197 % (b/v); control (- ); control (+), then incubated at room temperature for 24 hours. The result of dilution of each tube was inoculated on
medium with incised VJA. Diffusion method was carried out by pitting made 9 mm in diameter, then drops to n-hexane extract, ethyl acetate and ethanol 70 % at concentrations 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, and each form of 50 µ l, and then measured the diameter resisting. The experimental results antibacterial activity against Staphylococcus aureus ethyl acetate extracts have the MBC 25 % (b/v); 50 % (b/v), 100 % (b/v), ethanol 70 % extract has MBC 50 % (b/v); 100 % (b/v). While n- hexane extract did not give KBM. The research results of diffusion method provide average inhibition zone broad area of ethyl acetate extract of 7,67 mm (25 %); 11,33 mm (50 %); 20,33 mm (75 %); 26,67 mm (100 %), ethanol 70 % extracts gave inhibition area of 8,33 mm (50 %); 11 mm (75 %); 16 mm (100 %). While n-hexane extract did not provide regional inhibition. It can be concluded that the ethyl acetate extract is more effective as an antibacterial against Staphylococcus aureus compared with n-hexane extract and ethanol 70 %. Key words: Hibiscus sabdariffa L. n-hexane extract, ethyl acetate extract, ethanol 70 % extract, Staphylococcus aureus, antibacterial.
PENDAHULUAN Rosella (Hibiscus sabdariffa L.), di Indonesia penggunaannya belum begitu populer di bidang kesehatan. Namun akhir-akhir ini, Rosella telah banyak dimanfaatkan sebagai bahan obat tradisional baik untuk pengobatan luar maupun untuk pengobatan dalam. Daun Rosella mengandung saponin, flavonoida, dan polifenol (Depkes 2001). Staphylococcus aureus adalah suatu kokus tidak berflagela, tidak bergerak, bakteri Gram positif, sel-sel berbentuk bola, berdiameter 0,5-1,5 µm, bergerombol menyerupai untaian anggur, nonmotil, bersifat aerob, fakultatif anaerob, dinding sel mengandung dua komponen utama yaitu peptidoglikan serta asam tekoat (Shulman dkk 1994). Uji aktivitas terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dalam penelitian ini menggunakan ekstrak daun Rosella dan menggunakan metode difusi dan dilusi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak daun Rosella (Hibiscus Sabdariffa L.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923. Mengetahui Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) serta luas daerah hambat dari ekstrak n -heksan, etil asetat dan etanol 70 % daun Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.) terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923. Mengetahui ekstrak manakah yang lebih efektif terhadap aktivitas antibakteri ekstrak daun Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dalam berbagai pelarut. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan ilmu pengetahuan dalam bidang obat tradisional dan digunakan sebagai masukan bagi masyarakat dalam upaya pemanfaatan daun Rosella (Hibiscus Sabdariffa L.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923. Disinyalir bahwa ekstrak daun Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.) mempunyai aktivitas antibakteri. Ekstrak daun Rosella pada konsentrasi tertentu mempunyai aktivitas terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923. Ekstrak teraktif yang menghambat dan membunuh Staphylococcus aureus masih bersifat exploratif. METODE PENELITIAN Variabel utama pertama adalah ekstrak daun Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.) yang diperoleh dengan metode soxhletasi bertingkat dengan pelarut n -heksan, etil asetat dan etanol 70 %. Variabel utama kedua penelitian adalah bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus ATCC 25923. Variabel bebas dalam penelitian adalah ekstrak daun Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.) yang diperoleh dari hasil soxhletasi bertingkat daun Rosella yang dibuat menggunakan pelarut n heksan, etil asetat dan etanol 70 % yang diberikan dalam beberapa konsentrasi. Variabel terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi laboratorium meliputi kondisi entkas, alat, dan bahan yang digunakan harus steril dan media yang digunakan dalam penelitian. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah pertumbuhan Staphylococcus aureus ATCC 25923 dipengaruhi oleh ekstrak soxhletasi yang dilihat dari kekeruhan media.
A. Bahan dan Alat Bahan: Bahan sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.) yang diambil dari daerah Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah. Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Staphylococcus aureus ATCC 25923 yang diperoleh dari pembiakan sendiri. Medium yang digunakan dalam penelitian ini adalah Mueller Hinton Agar (MHA), Brain Heart Infusion (BHI ), Nutrien Agar (NA), Vogel Johnson agar (VJA). Bahan kimia yang digunakan adalah pelarut n -heksan, etil asetat, dan etanol 70 %, xylen, serbuk Mg, alkohol-asam klorida (1:1), amil alkohol, asam asetat, H 2SO4 pekat, asam klorida 2 N, Fehling A, dan Fehling B. Alat: Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat timbang analisa yang mempunyai ketelitian baca minimum 0,1 mg dan daya muat maksimum 100 gram, entkas, boor prop, ose platina, piring petri, flakon, tabung reaksi, gelas ukur, pipet tetes, neraca analitis, volume pipet (10 ml; 5 ml; 1ml; 0,5 ml), siring, pinset, inkubator, kertas saring, kapas, corong kaca, autoclave, mikroskop, kaca obyek, deglas, penangas air, seperangkat alat soxhlet, Sterling-Bidwell, pembakar spiritus, kasa, kaki tiga, selang, corong kaca, dan alat destilasi. B. Prosedur Penelitian C. Determinasi tanaman Determinasi tanaman dalam tahap penelitian ini adalah menetapkan kebenaran sampel tanaman Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) yang berkaitan dengan ciri-ciri makroskopis dan mencocokan morfologis yang ada dalam tanaman yang akan diteliti dengan kunci determinasi pada buku FLORA Untuk Sekolah di Indonesia By Dr. C.G.G.J Van Steenis, Determinasi dilakukan di Laboratorium Morfologi Sistematik Tumbuhan Universitas Setia Budi Surakarta. Pembuatan serbuk daun Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) Daun Rosella diambil dari B2P2TO2T Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah, dengan ciri-ciri seperti yang didapatkan dari hasil determinasi. Daun yang dipetik adalah daun yang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua yang masih segar pada saat cuaca kering. Daun yang dipanen dicuci dengan air untuk menghilangkan kotoran dan cemaran, dikeringkan dengan oven pada suhu 40 oC. Pembuatan serbuk menggunakan ayakan ukuran 20 Mesh. Hasil penyerbukan yang berupa serbuk kering disimpan dalam wadah kering dan tertutup rapat yang selanjutnya digunakan untuk penelitian. Penetapan susut pengeringan Penetapan susut pengeringan dilakukan yakni pada bentuk serbuk dan pada bentuk ekstrak daun Rosella. Serbuk daun Rosella dilakukan dengan cara menimbang serbuk daun Rosella sebanyak 2 gram, kemudian dikeringkan pada oven dengan suhu 105 oC selama 15 menit, setelah itu dimasukkan desikator hingga suhu kamar selanjutnya ditimbang, lalu dikeringkan lagi di oven hingga bobot konstan. Hasil susut pengeringan dihitung dalam satuan persen (%). Ekstrak hasil soxhletasi ditimbang sebanyak 2 gram, kemudian dikeringkan di oven pada suhu 105 oC, setelah itu dimasukkan desikator hingga suhu kamar selanjutnya ditimbang, lalu dikeringkan lagi di oven hingga bobot konstan. Hasil susut pengeringan dihitung dalam satuan persen (%). Identifikasi serbuk daun Rosella: Organoleptis serbuk. Identifikasi serbuk daun Rosella secara organoleptis bentuk, warna, bau dan rasa dari serbuk daun Rosella. Mikroskopis serbuk. Serbuk daun Rosella diletakkan diatas object glass kemudian ditetesi dengan kloralhidrat dan dilakukan penelitian mikroskopis. Makroskopis serbuk. Makroskopis daun rosellla dapat diperoleh dengan melihat serbuk, dilihat warna, bentuk dan ukuran serbuk.
Identifikasi kandungan senyawa kimia serbuk daun Rosella Identifikasi kandungan kimia dimaksudkan untuk menetapkan kebenaran kandungan kimia yang terkandung dalam serbuk daun Rosella. Identifikasi senyawa saponin, flavonoid dan polifenol dibuktikan di Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi Surakarta. Pembuatan ekstrak n -heksan, etil asetat dan etanol 70 % Serbuk daun Rosella ditimbang sebanyak 50,0 g kemudian dibungkus dengan kertas saring dan kedua ujungnya diikat dengan benang. Sampel kemudian dimasukkan dalam alat soxhletasi. Lalu diisi dengan pelarut n -heksan, etil asetat, dan etanol 70 % sebanyak satu setengah sirkulasi. Ekstraksi dilakukan dengan memanaskan labu dan dibiarkan sampai beberapa kali hingga larutan dalam tabung soxhletasi berwarna jernih. Ekstrak yang diperoleh kemudian dipekatkan dalam penangas air. Uji bebas etanol 70 % ekstrak soxhletasi daun Rosella Ekstrak soxhletasi diuji bebas etanol 70 % dengan penambahan asam asetat dan asam sulfat pekat dibantu dengan pemanasan. Ekstrak dinyatakan bebas etanol bila tidak ada bau ester yang khas dari etanol (Praeparandi 1979). Identifikasi bakteri uji Suspensi bakteri uji Staphylococcus aureus ATCC 25923 diinokulasikan pada medium VJA yang sudah ditambahkan tellurit 1 %. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Hasil pengujian ditunjukkan dengan warna koloni hitam dan warna medium disekitar koloni kuning. Hasil dari identifikasi Staphylococcus aureus 25923 pada media VJA selanjutnya diberi perlakuan uji biokimia yaitu uji koagulase dan uji katalase. Pembuatan suspensi bakteri uji Bakteri uji Staphylococcus aureus ATCC 25923 dari biakan murni pada media Nutrien Agar (NA) diambil kurang lebih 2 ose dan dibuat suspensi dalam tabung yang berisi media Brain Heart Infusion (BHI) yang kekeruhannya disesuaikan dengan kekeruhan Standart Brown II yang dianggap setara dengan 678 juta per ml bakteri Staphylococcus aureus . Kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 2 – 5 jam (Bonang dan Koeswardono 1982). Pengujian antibakteri Ekstrak Soxhletasi yang terdiri dari ekstrak n -heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak etanol 70 % daun Rosella yang didapatkan diuji secara mikrobiologi dengan bakteri uji Staphylococcus aureus ATCC 25923 dengan Metode dilusi dan difusi. HASIL DAN PEMBAHASAN Pertama, pengujian dilusi dilakukan dengan pengulangan tiga kali percobaan. Konsentrasi ekstrak soxhletasi daun Rosella yang digunakan yaitu: kontrol negatif; 100 % (b/v); 50 % (b/v); 25 % (b/v); 12,5 % (b/v); 6,25 % (b/v); 3,13 % (b/v); 1,57 % (b/v); 0,79 % (b/v); 0,39 % (b/v); 0,197 % (b/v); kontrol positif. Aktivitas antibakteri ekstrak dapat terlihat setelah diinokulasi pada medium agar. Konsentrasi Bunuh Minimum ditentukan pada medium VJA dengan konsentrasi minimum yang tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri.
Tabel Hasil inokulasi
Konsentrasi Kontrol (-) 100 % 50 % 25 % 12,5 % 6,25 % 3,13 % 1,57 % 0,79 % 0,39 % 0,157 % Kontrol (+) Keterangan:
Hasil inokulasi Staphylococcus aureus ATCC 25923 Ekstrak n -heksan Ekstrak etil asetat Ekstrak etanol 70 % I II III I II III I II III + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - = tidak ada pertumbuhan bakteri + = ada pertumbuhan bakteri Kontrol (-) = berisi ekstrak soxhletasi daun Rosella Kontrol (+) = berisi suspensi bakteri
Uji dilusi nilai Konsentrasi Hambat Minimum tidak dapat ditentukan maka dilakukan penginokulasian pada media VJA untuk dapat diketahui nilai Konsentrasi Bunuh Minimum. Hasil inokulasi menunjukkan bahwa ekstrak soxhletasi daun Rosella dari tabung dilusi yang menggunakan tiga macam ekstrak mempunyai hasil yang berbeda-beda, yaitu ekstrak n -heksan tidak efektif membunuh Staphylococcus aureus ATCC 25923. Ekstrak etil asetat efektif membunuh Staphylococcus aureus ATCC 25923 pada KBM 25 % (b/v); 50 % (b/v); 100 % (b/v) dan ekstrak etanol 70 % efektif membunuh Staphylococcus aureus ATCC 25923 pada KBM 50 % (b/v); 100 % (b/v), dari ketiga ekstrak tersebut yang paling efektif adalah ekstrak etil asetat yang mempunyai daya bunuh terbesar pada konsentrasi 25 % (b/v). Kedua, dilakukan pengujian dengan metode difusi. Volume larutan uji sebanyak 50 µl dengan konsentrasi masing-masing sebanyak 25 %, 50 %, 75 %, 100 % dan blanko aquades. Jumlah bakteri yang digunakan disesuaikan dengan kekeruhan modifikasi standar brown II yang dianggap setara dengan 678 juta bakteri Staphylococcus aureus per ml (Bonang dan Koeswadono 1982). Masa inkubasi 24 jam pada suhu 37 oC. Hasil uji daya hambat daun Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.) terhadap bakteri uji dapat dilihat pada tabel di bawah. Tabel Diameter hambatan ekstrak soxhletasi n -heksan, etil asetat dan etanol 70 % daun Rosella terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 Diameter Hambat (mm) Jenis ekstrak Konsentrasi 25 % 50 % 75 % 100 % Kontrol(-) Ekstrak n 0 0 0 0 0 heksan 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ekstrak etil 7 11 20 25 0 asetat 7 10 21 30 0 9 13 20 25 0 Ekstrak etanol 0 8 11 16 0 70 % 0 9 12 17 0 0 8 10 15 0
Penelitian dengan ekstrak n -heksan tidak didapat Konsentrasi Hambat Minimum (KHM). Kemudian dari ekstrak etil asetat dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus ATCC 25923 pada konsentrasi 12,5 % (b/v) sedangkan ekstrak etanol 70 % dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus 25923 ATCC pada konsentrasi 25 % (b/v). Berdasarkan uji aktivitas antibakteri ekstrak n -heksan, etil asetat dan etanol 70 % daun Rosella didapat hasil bahwa ekstrak etil asetat mempunyai daya bunuh yang paling besar. Ekstrak etil asetat lebih efektif dibandingkan dengan ekstrak n -heksan dan ekstrak etanol 70 %, mekanisme kerjanya terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 belum diketahui dengan pasti. Pada ekstrak etanol 70 % mengandung semua senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri baik polar maupun non polar. Efek antibakteri ekstrak etanol 70 % disebabkan adanya senyawa kimia yang terkandung didalam ekstrak etanol 70 % yaitu senyawa flavonoid, saponin, dan polifenol. Sebab etanol 70 % dapat melarutkan senyawa flavonoid, saponin dan polifenol. Disamping itu juga dapat melarutkan alkaloid basa, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, steroid, klorofil, damar dan tanin. Senyawa saponin dapat bekerja sebagai antimikroba dengan cara merusak membran sitoplasma dan membunuh sel. KESIMPULAN Ekstrak soxhletasi daun Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.) mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923. Konsentrasi Bunuh Minimum ekstrak etil asetat adalah 25 % (b/v); 50 % (b/v); 100 % (b/v), KBM ekstrak etanol 70 % terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 adalah 50 % (b/v); 100 % (b/v) dan tidak didapat Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dari ekstrak n heksan. Dalam penelitian ini tidak didapat luas daerah hambat dari ekstrak n -heksan terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923, luas daerah hambat rata-rata dari ekstrak etil asetat adalah 7,67 mm (25 %); 11,33 mm (50 %); 20,33 mm (75 %); 26,67 mm (100 %). Dan luas daerah hambat rata-rata dari ekstrak etanol 70 % adalah 8,33 mm (50 %); 11 mm (75 %); 16 mm (100 %). Dari ketiga ekstrak tersebut yang paling efektif terhadap aktivitas antibakteri adalah ekstrak etil asetat yang mempunyai daya bunuh terbesar pada konsentrasi 25 % (b/v). DAFTAR PUSTAKA Anonim. http:// www.plantamor.com/ spcdtail. php? recid=677 & popname = Rosela, 13.37;30/10/2009. Anonim. http://bahan-alam.fa.itb.ac.id, 14.37:11/4/2009. Ansel, H. C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi IV . Jakarta: Universitas Indonesia. hlm 410-417. Gunawan & Mulyani. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) Jilid 1. Jakarta: Penebar swadaya. Hlm 9-13. Harborne. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. , Bandung: Penerbit ITB. hlm 102, 152 Maryani dan Kristiana. 2008. Khasiat dan Manfaat Rosella . Jakarta: AgroMedia Pustaka, hlm 2-26. Salle, A. J., 1978. Fundamental Principles of Bacteriology , 7th ed, Tata Mc Graw-Hill, Pablishing Company LRD, Inc, New Delli, hlm 559. Shulman, Dhair, Sommers. 1994. Dasar Biologi dan Klinis Penyakit Infeksi , Yogyakarta: Universitas Gajah Mada. hlm 55-59. Suriawiria, U. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum , Penerbit Angkasa, Bandung, 60-61, 5758. Voight, R. 1995. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi , diterjemahkan oleh Mathilda B Widianto, Edisi V, Gajah Mada University Press, Yogyakarta.
