123+E4$3/5/ E41525 "56E7528 HE4E/35 95"1L75/ /E "3E2"35$ 6 93L8$89:5 4;"73"5$ /E L5<84578438 E2 <38=1:>3"5 $E?12/8 $E>E$74E @ ABBC
PRÁCTICA # 6 TÍTULO: CINÉTICA ENZIMÁTICA
Introducción Las Las reacc reaccio ione ness meta metaból bólic icas as confo conform rman an un cuerp cuerpoo de reac reacci cion ones es qu quím ímic icas as qu quee ocurr ocurren en en condiciones muy particulares (temperatura, pH, concentración de reactantes y productos) y que son necesarias para que los seres vivos cumplan con sus funciones biológicas. Estas condiciones particulares en las que las reacciones metabólicas deben darse son características de los organismos, organismos, órganos, tejidos tejidos o clulas, clulas, y en ausencia de un catali!ador, catali!ador, no suelen suelen permitir permitir que se generen los productos a la velocidad requerida. "iertas proteínas #an evolucionado entonces como catali!adore catali!adoress biológicos biológicos cuya función es aumentar la velocidad velocidad de las reacciones químicas químicas en los seres vivos. Es importante recordar que este aumento en la velocidad de reacción se logra mediante la disminución de la energía de activación de los reactantes y que nada tiene que ver con el cambio de energía libre que ocurre al convertirse los reactantes en productos. En trminos simples, la relación entre la velocidad de la reacción y la concentración de sustrato ($, reactante) en una reacción catali!ada por una en!ima (E) est% dada por la ecuación de Micha!i" Mntn de acuerdo al esquema siguiente& k -1
k 2
E ' $ E$ E '
k +1, k -1 y k 2 & constantes de velocidad
k +1
v * +ma-$ K m ' -$ /onde, en condiciones de estado estable (velocidad de formación de E$ * velocidad de descomposición de E$)& v * velocidad de reacción a una determinada concentración de sustrato -$ * concentración de sustrato +ma * velocidad m%ima alcan!able a la concentración de en!ima dada K m * constante de disociación aparente de E$ * (k -1 ' k 2)0k +1
Los valores de K m y +ma son Dtiles para caracteri!ar el funcionamiento de una en!ima con un sustrato específico. El K m mantiene un relación inversa con la afinidad de la en!ima por el sustrato, y si se conoce la concentración de la en!ima (-E), la +ma permite el c%lculo de la constante de cat%lisis de sta (k cat * k 2 * +ma0-E). La k cat es equivalente al nDmero de reacciones que un sitio activo de la en!ima catali!a por unidad de tiempo. El cociente k cat 0 K m toma en cuenta ambos par%metros para estimar la eficiencia catalítica de la en!ima, entendida sta como la f recuencia en que la en!ima transformar% el sustrato en producto cada ve! que se encuentre con l (a mayor k cat -mayor velocidad y menor K m -mayor afinidad, mayor eficiencia). En la pr%ctica, los valores de K m y +ma pueden estimarse a partir de gr%ficas de funciones derivadas de la ecuación de Micha!i" Mntn. 1na primera ecuación derivada es la de Lin$a%r &ur' & 0v * ( K m0+ma) . 0-$ ' 0+ma ?raficando la inversa de las velocidades de reacción que se obtienen eperimentalmente (eje FyG) versus la inversa de las concentraciones de sustrato respectivas (eje FG), se obtiene una recta cuya intersección con el eje FyG da la inversa de +ma y cuya pendiente es equivalente a K m0+ma. 1na ecuación derivada alternativa es la de Eadi (o)"t& v * @ K m . (v0-$) ' +ma En este caso, graficando las velocidades de reacción que se obtienen eperimentalmente (eje FyG) versus el cociente entre dic#a velocidad y la concentración de sustrato correspondiente (eje FG), se obtiene una recta cuya intersección con el eje FyG es directamente el valor de + ma y cuya pendiente es - K m. En esta pr%ctica se #ar% la caracteri!ación cintica de la pira!inamidasa de Mycobacterium tuberculosis. Esta en!ima es epresada en cepas sensibles a la pira!inamida, compuesto que se utili!a para el tratamiento de la tuberculosis y que es un an%logo de la nicotinamida (vitamina <). La pira!inamidasa pertenece a la familia de las #idrolasas y catali!a la #idrólisis de la pira!inamida para producir %cido pira!inoico (forma activa de la droga) y amonio, de acuerdo a la reacción siguiente&
ara #acer el estudio cintico de esta en!ima, se incubar% una concentración conocida de pira!inamidasa recombinante con diferentes concentraciones de pira!inamida y se medir%n las velocidades de reacción correspondientes estimando la cantidad de %cido pira!inoico producido durante el tiempo de incubación. La adición de sulfato de amonio ferroso permitir% la formación de una sal ferrosa roji!a y soluble a partir del %cido pira!inoico (reacción de Iayne), la cual ser% cuantificada en el espectrofotómetro a JKB nm de longitud de onda (Em>.cm@ * JJ.J) luego de detener la reacción en!im%tica con buffer glicina.H"l BB m>, pH .J.
Racción d *an
O+,ti%o" . >edir la velocidad de reacción de la pira!inamidasa con distintas concentraciones de pira!inamida. A. Estimar los par%metros cinticos K m y k cat a partir de los datos eperimentales. . 3dentificar factores eperimentales que resultan críticos para la estimación de los par%metros cinticos de la en!ima.
Matria!" Racti%o" @ @ @ @ @ @ @ @ @ @ @ @ @ @ @ @
ira!inamidasa BB µ> en buffer fosfato BB m>, pH C.J ira!inamida , K, B y JB m> en buffer fosfato BB m>, pH C.J , pH C.J , pH .J $ulfato de amonio ferroso al ABM en HA8 5gua destilada ?radilla de tubos 7ubos de vidrio >icropipetas untas "ronómetro Espectrofotómetro "ubetas apel milimetrado Hielo 4ecipientes de desec#o
Procdi-into 4otular los tubos a ser utili!ados indicando las concentraciones de sustrato correspondientes. "ada tubo (concentración de sustrato) " tra+a,ar. indi%idua!-nt, y en cada uno se aNadir%n los reactivos en el orden y cantidad indicados en la tabla siguiente&
&u))r )o")ato 7 L8 (2 O 7 L8 Pira9ina-ida"a 7 L8 Pira9ina-ida 5 -M 7 L8 Pira9ina-ida -M 7 L8 Pira9ina-ida 5/ -M 7 L8 Pira9ina-ida 3/ -M 7 L8
/ /12 /13 /16 /14 51 2 3 4 5/ -M0 -M -M0 -M -M0 -M -M0 -M -M0 -M KB KB KB KB KB KB KB KB KB KB JK
AK
K
AO
B
AK
K
AK
AB
K
K
K
K
K
K
K
K
K
K
@@@@
AB
JB
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
A
C
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
K
AB
JB
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
@@@@
AB
AK
Luego de aNadida la pira!inamida (sustrato), se me!clar% el contenido golpeando suavemente con el dedo la base del tubo mientras se activa el cronómetro para dar minuto de incubación a temperatura ambiente. asado el minuto se agregar%n B µL de la solución de sulfato de amonio ferroso al ABM, se agitar% suavemente el tubo y se aNadir%n inmediatamente OB µL del buffer glicina.H"l BB m>, pH .J para detener la reacción. 1na ve! completados los B tubos, se proceder% a leer la absorbancia a JKB nm en un espectrofotómetro utili!ando el primer tubo (B m>) como blanco. La concentración de %cido pira!inoico producido ser% calculada a partir del coeficiente de etinción molar de la sal ferrosa producida durante la reacción de Iayne mediante la fórmula siguiente& -%cido pira!inoico (m>) * A B absorbancia0JJ.J "omo la reacción #a ocurrido en minuto, este mismo valor corresponder% a la velocidad epresada en m>0min. 1na ve! calculadas las velocidades correspondientes a las diferentes concentraciones de sustrato, se graficar%n los datos en papel milimetrado de acuerdo a las ecuaciones de Lin$a%r &ur' y Eadi (o)"t para estimar los valores de K m y +ma. 7eniendo en cuenta que la concentración de en!ima utili!ada #a sido BB µ>, se calcular%n la k cat y la relación k cat0 K m. 9inalmente, se repetir% el mismo procedimiento con las concentraciones que aparecen en la tabla con un asterisco pero esta ve! incubando por B min. Au; "
para calcular la velocidad, se debe dividir en este caso las concentraciones de %cido pira!inoico obtenidas entre B.
Pr=unta" . /educir las ecuaciones de Lin$a%r &ur' y Eadi (o)"t a partir de la ecuación de Micha!i" Mntn. A. P=u diferencias encuentra entre los gr%ficos obtenidos por los mtodos deLin$a%r &ur' y Eadi (o)"tQ P=u ventajas y desventajas encuentra en cada uno de estos mtodosQ . P=u ocurre cuando la incubación se reali!a durante B min en lugar de minQ P$e alteran los par%metros cinticosQ Eplique las ra!ones.
