LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKULER EKSTRAKSI DNA, REAKSI BERANTAI POLIMERASE (PCR) DAN ELEKTROFORESIS
Oleh : Ahmad Fadli 2011 38 001
POGRAM STUDI BIOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI PAPUA MANOKWARI 2013
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Maulana dkk, 2010). DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Maulana dkk, 2010). Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkahlangkah kerja analisis DNA analisis DNA sequencing . Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak (Sutomo, 2002). 2002). Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen
1
DNA
dalam
jumlah
jutaan
kali
hanya
dalam
beberapa
jam.
Dengan
diketemukannya teknik PCR di samping juga teknik-teknik lain seperti sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains dan teknologi khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan evolusi molekular (Handoyo dan Ari, 2000). Elektroforesis merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang Biokimia dan Biologi Molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi, memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis) (Jusuf, 2001). Berdasarkan latar belakang tersebut, praktikum ini penting dilakukan oleh mahasiswa untuk mempelajari metode-metode dalam ekstraksi DNA, PCR dan elektroforesis yang biasa dilakukan dalam analisis DNA dalam bidang Biologi Molekuler.
1.2 Tujuan
Tujuan dilakukanya praktikum ini adalah : 1. Mempelajari bagaimana mengekstraksi DNA. 2. Mempelajari bagaimana proses ekstraksi DNA. 3. Mempelajari bagaimana mengamplifikasi fragmen DNA. 4. Mempelajari bagaimana kerja PCR. 5. Mempelajari bagaimana melakukan analisis dengan gel agarosa dan poliakrilamida 6. Mempelajari bagaimana kerja elektorofresis gel agarosa dan bagaimana menentukan ukuran fragmen DNA. 7. Mempelajari bagaimana elektroforesis gel poliakrilamida bekerja.
2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Ekstraksi DNA
Komponen utama kromosom pada eukariota adalah molekul DNA dan protein histon. Protein histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat asam dari DNA. Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan DNA. DNA yang dijumpai di nukleus disebut DNA kromosomal, DNA lain yang terdapat dalam sel di luar nukleus yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA plasmid, ketiganya disebut DNA ekstrakromosomal (Fatchiyah dkk., 2012). Ekstraksi DNA adalah prosedur umum memisahkan dan mengumpulkan DNA untuk analisis rekayasa genetika, forensik, bioinformatika, komputasi, analisis asal-usul dan antropologi. Ada beberapa teknik ekstraksi yang umum digunakan dalam teknologi DNA termasuk teknik Chelex. Teknik ini dikembangkan tahun 1991 dan hanya dapat digunakan untuk persiapan PCR. Meskipun memiiiki keterbatasan, teknik ini unggul dalam hal cepat, murah dan efektif untuk ekstraksi DNA. Metode chelex disarankan untuk preparasi DNA karena tidak membutuhkan tabung-tabung untuk transfer. Metode ini cepat dan menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji kompleks PCR. Metode ini menjamin untuk menghasilkan sampel kecil sehingga disarankan untuk semua sampel yang diuji dengan berbagai ukuran dan volume sampel (Walsh and Higuchi, 1991).
2.1.1 Prinsip Dasar Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA berarti mengeluarkan DNA dari sel. Teknik Chelex umumnya
mengeluarkan
DNA
untai
tunggal
menggunakan
prosedur
penambahan suspensi "resin-chelat" secara langsung untuk spesimen (darah, noda darah, semen sebagai contoh) kemudian melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen, magnesium. Dalam tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya. Ada beberapa tahap dasar dalam ekstraksi DNA, yang rinciannya dapat berbeda tergantung jenis sampel dan senyawa yang mempengaruhi ekstraksi dan analisis lanjut (Walsh and Higuchi, 1991).
3
• Memecahkan sel (lisis) melalui sonikasi, dan menghancurkan lipid membran dengan penambahan detergen seperti SDS. Melakukan vorteks dengan fenol (kadang-kadang dipanaskan) sering efektif untuk memecahkan protein dinding sel. • Mengeluarkan sel dan protein histon yang terikat dengan DNA melalui penambahan protease
dalam presipitasi
dengan
garam atau
asetat
ammonium, atau dengan menggunakan ekstrasi fenol-kloroform. • Presipitasi DNA dalam etanol atau isopropanol dingin, DNA dapat larut di dalam alkohol dan berikatan bersama, tahap ini juga melepaskan garam. • Cuci pelet DNA dengan alkohol lagi dan sentrifugasi untuk mendapatkan kembeli peletnya. • Melarutkan DNA dalam buffer alkalin Tahap pertama prosedur ekstraksi DNA adalah memanaskan sejumlah jaringan dalam larutan Chelex. Pemanasan tersebut membantu memecahkan sel dan mendenaturasi protein. Chelex melindungi sampel dari DNAse dan mencegah sampel dari kontaminan (Walsh and Higuchi, 1991).
2.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR)
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. PCR adalah teknik in vitro yang dapat mengamplifikasi bagian DNA spesifik yang terletak di antara dua bagian DNA yang telah diketahui. PCR merupakan teknik biokimia dan biologi molekuler untuk isolasi dan amplifikasi secara eksponensial fragmen atau urutan sasaran DNA melalui replikasi enzimatik, atau tanpa menggunakan mahluk hidup (seperti E. coli atau ragi). Karena PCR merupakan teknik in vitro, teknik ini dapat digunakan tanpa memotong DNA, dan dapat dimodifikasi secara ekstensif untuk mengikuti aturan luas manipulasi genetik (Fatchiyah dkk., 2012). PCR ditemukan oleh Kary Mullis tahun 1983. PCR menjadi teknik umum yang digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai keperluan, seperti pengurutan gen-gen dan diagnosis penyakit turunan, identifikasi sidik-jari genetik (digunakan dalam pengujian forensik dan paternitas), deteksi
4
dan diagnosis penyakit infeksi, dan pembentukan organisme transgenik. PCR juga digunakan dalam biosistematika, biologi populasi, biologi konservasi, ekologi, biologi perkembangan, dan genetika (Binur, 2013). Keuntungan menggunakan PCR adalah: 1. Deteksi dan identifikasi mikroorganisme secara cepat pada frekuensi yang sangat rendah, mikroorganisme simbiotik, dan individu ikan dan larva avertebrata; 2. Analisis cepat genom individu untuk mempelajari populasi; 3. Deteksi dan analisis "kejadian langka" yang terjadi pada fraksi sel kecil dalam sampel jaringan atau kolesi lapangan; dan 4. Menduga kuaiitas air melalui deteksi virus, bakteri, dan/atau parasit pathogen. Keuntungan lain PCR adalah mengurangi keperluan kultur yang sering ditemukan untuk spesies atau jenis mikroba yang tidak dapat dikultur untuk kepentingan ekologi atau biogeokimia. Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106 - 107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target (Fatchiyah dkk., 2012). Tabel 1. Amplifikasi Geometrik (X=2n) Siklus PCR Jumlah Relatif Molekul 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 10 1.024 20 1.048.576 30 1.073.741.824 Sumber : Fatchiyah dkk., 2012 2.2.1 Prinsip Dasar PCR
PCR ( Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara
5
mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target disebut forward dan yang berada setelah daerah target disebut reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR diperlukan dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasis Adenin), dCTP (Cytosine), dGTP (Guanine) dan dTTP (Thymine) (Muladno, 2010). PCR digunakan untuk mengamplifikasi gen tunggal, bagian gen, atau urutan non-kode DNA. PCR akan membuat sekitar 40 milyar salinan dari DNA cetakan. Kebanyakan metode PCR dapat mengamplifikasi fragmen DNA sampai 10 kilo pasang basa (kb), meskipun beberapa teknik dapat mengamplifikasi fragmen berukuran sampai 40 kb (Binur, 2013). Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi (pemanjangan) oleh enzim DNA polimerase. Taq DNA polymerase diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun 1988. Enzim ini tahan sampai temperature mendidih 100° C, dan aktifitas maksimal pada temperatur 70 o - 72° C. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung- 5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan (Fatchiyah dkk., 2012). PCR biasanya terdiri atas 20 sampai 35 siklus. Kebanyakan PCR dilakukan dalam tiga tahap, yang didahului satu suhu tetap untuk awal dan diikuti satu suhu lagi untuk akhir (Binur, 2013). 1. Tahap Inisiasi/Denaturasi. Sebelum tahap inisiasi reaksi PCR sering dipanaskan pada suhu 94° - 96° C (atau 98° C jika menggunakan polimerase termostabil), selama 1 - 9 menit. Ini berguna untuk menjamin banyak cetakan DNA dan primer terdenaturasi yaitu putusnya ikatan hidrogen basa-basa komplemen rantai DNA untuk menghasilkan rantai tunggal DNA. Beberapa polimerase PCR juga membutukan kondisi tahap
6
ini untuk aktivasi (PCR awal-panas). Setelah itu, mulai siklus dengan tahap satu pada 94° - 98° C selama 20 - 30 detik (tahap denaturasi). 2. Tahap annealing / Penempelan. Dalam tahap ini suhu reaksi diturunkan sehingga primer dapat menempel pada cetakan DNA rantai tunggal. Gerakan
Brownian menyebabkan primer bergerak di sekitar ikatan
hidrogen DNA-DNA yang secara konstan dibentuk dan diputuskan antara primer dan cetakan. Ikatan stabil hanya terbentuk bila urutan primer sa ngat sesuai dengan urutan cetakan. Bagian pendek DNA rantai ganda ini dikatalisis oleh polimerase untuk memulai sintesis DNA. Suhu pada tahap ini bergantung pada suhu leleh primer dan biasanya antara 50° - 64° C selama 20 - 40 detik. 3. Tahap Ekstensi/Pemanjangan yaitu DNA polimerase memperpanjang rantai DNA primer yang komplemen dengan rantai cetakan DNA. Suhu pada tahap ini bergantung pada enzim DNA polimerase yang digunakan. Polimerase Taq mempunyai suhu optimum 70° - 74° C. Umumnya reaksi tahap ini menggunakan suhu 72° C. DNA polimerase melakukan kondensasi gugus 5-fosfat dNTP dengan gugus 3'-hidroksil pada ujung awal rantai DNA yang komplemen dengan cetakan dalam arah 5' ke 3'. Waktu pemanjangan bergantung pada DNA polimerase dan panjang bagian DNA yang akan diampiifikasi. Tahap elongasi (peanjangan) akhir selama 5 - 15 menit (tergantung panjang cetakan DNA) setelah siklus terakhir dapat digunakan untuk menjamin DNA rantai tunggal sisa diperpanjang seluruhnya. Akhirnya jaga suhu 4° - 15°C selama waktu terbatas untuk penyimpanan singkat selama reaksi misalnya jika reaksi dikerjakan semalam. Secara ringkas, prinsip pelipatgandaan jumlah molekul DNA pada target yang diinginkan melalui teknik PCR dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada suhu 95o C, molekul DNA mengalami denaturasi sehingga struktur berubah dari untai ganda menjadi untai tunggal. Pada suhu berkisar antara 50 o C sampai 60o C, primer, forward yang runutan nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu untai tunggal akan menempel pada posisi komplemennya. Demikian juga primer reversenya akan menempel pada untai tunggal lainnya. Setelah kedua primer
7
tersebut menempel pada posisinya masing-masing enzim polymerase mulai mensintesis molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 3’ nya masing -masing primer pada suhu 72o C. Proses ini disebut ekstensi. Dengan demikian, satu molekul DNA ganda akan berlipat jumlahnya menjadi dua molekul DNA. Setelah itu diulangi proses denatuasi, penempelan (annealing), ekstensi (pemanjangan) yang disebut sebagai satu siklus. Proses PCR biasanya berlangsung 35 - 40 siklus (Muladno, 2010).
Gambar 1. Siklus dasar PCR. A. Sistem tiga temperatur yang berbeda. B. Kenaikan hasil amplifikasi menunjukkan pertumbuhan sigmoid (Fatchiyah dkk., 2012).
8
2.2.2 Prosedur (Untuk Awal - Panas, Amplifikasi Rantai Ganda)
Reaksi PCR dilakukan dalam tabung reaksi kecil (volume 0.2 - 0.5 ml) yang mengandung volume reaksi antara 15 - 100 µl, yang dimasukkan di dalam mesin thermal cycler . Mesin memanaskan dan mendinginkan tabung reaksi sesuai dengan suhu yang diinginkan untuk setiap tahap reaksi. Kebanyakan mesin memiliki penutup panas untuk mencegah kondensasi bagian dalam tutup tabung reaksi. Kalau tidak, lapisan minyak dapat ditempatkan pada campuran reaksi untuk mencegah evaporasi (Binur, 2013). Menurut Binur (2013) PCR membutuhkan beberapa komponen dasar seperti: • DNA cetakan yang mengandung daerah bagian DNA yang akan diamplifikasi. • Satu atau lebih primer yang komplemen dengan bagian DNA pada ujung 5' dan ujung 3' bagian DNA yang akan diamplifikasi. • DNA polimerase (misalnya polimerase Taq atau DNA polimerase lain dengan suhu optimum sekitar 70° C) digunakan untuk sintesis salinan DNA bagian yang akan diamplifikasi. • Deoksinukleotida trifosfat (dNTP) yang digunakan DNA polimerase untuk membentuk DNA baru. • Larutan buffer, yang memberikan lingkungan kimia yang sesuai untuk aktifitas dan kestabilan optimum DNA polimerase. • Kation Divalen, ion magnesium atau mangan; umumnya menggunakan Mg2+, meskipun demikian Mn 2+ dapat digunakan untuk mutagenesis DNA PCR-mediated. Konsentrasi Mn2+ sangat tinggi dapat meningkatkan kesalahan selama sintesis DNA. • Kation Monovalen ion potassium.
2.3 Elektroforesis
Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh medan listrik. Molekul DNA termasuk senyawa bermuatan negatif. Sifat ini menjadikan molekul DNA yang ditempatkan pada medan listrik akan bermigrasi menuju kutub positif. Kecepatan migrasi molekul DNA tergantung
9
pada konsentrasi gel yang digunakan, ukuran molekul yang dianalisis, serta tegangan listrik yang diberikan. Salah satu gel yang dapat digunakan pada elektroforesis adalah gel agarosa. Agarosa digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen-fragmen DNA (Sambrook et al ., 1989). Mobilitas fragmen DNA pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh komposisi dan kelarutan ion buffer elektroforesis. Jika konsentrasi ion-ion sangat sedikit maka konduktifitas listrik sangat kecil dan migrasi DNA menjadi lambat. Konsentrasi ion yang berlebih akan mengakibatkan gel mencair dan DNA terdenaturasi. Selain buffer elektroforesis, teknik elektroforesis DNA juga memerlukan loading buffer. Buffer ini berfungsi meningkatkan densitas sampel sehingga fragmen tersebut berada di dasar well dan tidak menyebar. Fungsi lainnya adalah memberi warna pada fragmen DNA sehingga mempermudah pengamatan proses elektroforesis. Buffer ini dapat juga membantu pergerakan sampel ke anoda. Ukuran fragmen DNA hasil pemotongan dengan endonuklease restriksi dapat ditentukan dengan memakai penanda DNA (marker). Penanda DNA adalah fragmen DNA yang telah diketahui ukurannya (Sambrook et al .,1989). Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bermigrasinya molekul biologi dan untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulosa asetat dan gel. Gel yang dipakai dapat berupa pati, agarose ataupun poliakrilamid. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Dalam perangkat elektroforesis, gel diletakkan diantara dua buffer chamber sebagai sarana untuk menghubungkan kutub negatif dan kutub positif. Orientasi posisi gel dapat secara vertikal dan horisontal atau disebut sebagai submarine (Fatchiyah dkk., 2012).
2.3.1 Prinsip Dasar Elektroforesis
10
Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak dengan kata lain mobilitisnya tinggi. Sebaliknya, protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek dengan kata lain mobilitisnya rendah. Berbagai jenis protein pada suatu sampel akan terseparasi (terpisah-pisah) pada gel tergantung pada mobilitasnya. Protein dengan mobilitas tinggi akan berhenti bergerak pada bagian yang lebih bawah gel, sedangkan protein dengan mobilitas rendah cenderung berhenti bergerak pada bagian atas gel. Dengan demikian, pada jalur pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein (disebut sebagai band atau pita protein) yang sudah terseparasi berdasarkan berat molekulnya. Dalam satu sampel protein bisa lebih dari satu bahkan puluhan band dalam gel poliakrilamida. Dalam kondisi tidak diwarnai, protein tersebut tidak terlihat karena memang protein dalam sampel tidak berwarna. Setelah diwarna dengan staining solution yang mengandung Coomassie brilliant blue R-250, protein yang tidak berwarna tersebut menjadi berwarna biru karena mengikat Coomassie blue. Dalam kondisi ini kita bisa mengetahui keberadaan dan mengukur mobilitas protein untuk kemudian ditentukan berat molekulnya (Fatchiyah dkk., 2012). Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. pH bufer elektroforesis berkisar 8 - 9 yang akan menyebabkan sebagian besar protein bermuatan negatif yang akan bergerak ke anoda. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya (Fatchiyah dkk., 2012). Elekroforesis gel DNA yang berukuran besar biasanya menggunakan elektroforesis gel agarosa. Hasilnya dapat dianalisis secara kuantitatif melalui visualisasi gel dengan cahaya ultra violet dan peralatan gambamya. Gambar direkam dengan kamera yang dioperasikan dengan computer dan intensitas pita diukur dan dibandingkan dengan DNA baku atau penanda yang dimasukkan
11
pada gel yang sama. Pengukuran dan analisis kebanyakan dilakukan dengan perangkat lunak khusus (Binur, 2013). Perbedaan nyata antara pita dipengaruhi oleh persentase agarosa, waktu elekroforesis, konsentrasi Etidium Bromide, derajat superkoil dan ukuran serta kompleksitas DNA. Peningkatan konsentrasi agarosa gel mengurangi kecepatan migrasi dan kemampuan memisahkan molekul DNA lebih kecil. Lebih tinggi voltase, lebih cepat migrasi DNA. Tetapi volstase dibatasi oleh panas dan akhirnya dapat menyebabkan gel meleleh. Voltase tinggi juga mengurangi resolusinya (di atas 5 sampai 8 V/cm). Molekul lebih pendek bergerak lebih cepat daripada molekul lebih panjang (Binur, 2013). Pada elektroforesis dalam matriks gel poliakrilamid, protein terseparasi ketika protein bergerak melalui matriks tiga dimensi dalam medan listrik. Matriks poliakrilamid berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH bufer agar muatan protein tidak berubah. Poliakrilamid dapat memisahkan protein dengan kisaran berat molekul 500 - 250.000 atau polinukleotida dengan kisaran 5 - 2000 pasang basa. Pori matriks ini terbentuk dari ikatan silang antara akrilamid dan bisakrilamid. Ukuran pori pada gel poliakrilamid dapat dikecilkan dengan cara meningkatkan persentase total akrilamidatau
dengan
meningkatkan
banyaknya
ikatan
silang
dengan
bisakrilamid (Fatchiyah dkk., 2012).
12
BAB III METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 3 – 6 Desember 2013 yang bertempat di Laboratorium Bioteknologi Universitas Negeri Papua. Ekstraksi DNA dilakukan pada tanggal 3 Desember 2013 pukul 10.20 - 12.30 WIT, PCR dilakukan pada tanggal 5 Desember 2013 pukul 08.00 - 10.30 WIT dan Elektroforesis dilakukan pada tanggal 6 Desember 2013 pukul 08.00 - 10.30 WIT.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1
Ekstraksi DNA No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
3.2.2
Alat
Vorteks Mikrosentrifuge Alkohol burner Heating block Timer Spiner Pinset Gelas piala Pulpen waterproff Lembar kerja Chelex Microtube
Bahan Sampel (Kaki Renang Udang Galah) Larutan ekstraksi Chelex 10% Sarung tangan Alkohol Tisu
Reaksi Berantai Polimerase (PCR) No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Alat Mesin PCR (Thermal cycler ) Micropipet eppendrof Tip pipet Tube PCR + Rak Kalkulator Alat tulis Lembar kerja PCR Kotak sampah Pulpen waterproff Mikrosentrifuge/Spiner Sarung tangan
Bahan DNA template (Sampel hasil ekstraksi) Kontrol positif dan kontrol negatif ddH2O 10 x PCR Buffer (PE-II) dNTPs (8 µM) MgCl2 (25 mM) Primer 1 foward (10 mM) Primer 2 reverse (10 mM) PE Amplitaq (5 units/µL)
13
3.2.3
Elektroforesis No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Alat UV transluminator Micropipet eppendrof Tip pipet Neraca digital Tabung Erlenmeyer Mikrowave Spatula Kamera digiatl Sarung tangan putih + biru
Bahan
Agarose TAE Buffer EtBr ( Ethidium Bromida) ddH2O Produk smapel PCR Parafilm Loading dye DNA ladder
3.3 Cara Kerja 3.3.1 Ekstraksi DNA 1. Menggunakan sarung tangan dan mengambil sejumlah sampel udang galah yang akan diekstraksi. 2. Mengambil microtube yang berisi 0,65 mL Chelex dari lemari pendingin sebanyak jumlah sampel yang akan diekstraksi. 3. Mengisi lembar kerja Chelex dengan jenis Sampel, Tanggal, Metode Ekstraksi, Kode Sampel, dan Lokasi pengambilan sampel, kemudian menandai tabung (microtube) Chelex sesuai dengan daftar sampel dalam lembar kerja Chelex dengan menuliskan kode sampel pada tutup tabung dan tanggal ekstraksi di samping tabung. 4. Menghidupkan heating bock dan mengaturnya hingga suhu 95 o C. 5. Menuangkan alkohol 96% ke dalam gelas piala untuk mencuci penjepit (pinset). 6. Memasukkan pinset dalam alkohol lalu memanaskan dengan alkohol burner dan mengulaginya sebanyak 3 kali. 7. Menggunakan penjepit steril, mengambil potongan kecil dari jaringan sampel, membuka tutup tabung Chelex, memasukkan potongan sampel sebesar titik (.) ke dalam tabung Chelex yang sudah ditandai, lalu tabung ditutup kembali. 8. Mengulangi langkah 6 - 7 di atas untuk setiap sampel dengan tabung chelex baru, memastikan penjepit tetap steril dengan tiga kali pemanasan dengan dicelupkan terlebih dahulu kedalam alkohol antara sampel-sampel. 9. Setelah selesai, sampel-sampel dalam Chelex diaduk secukupnya selama 15 detik dan sampel-sampel dispin (diputar) selama 20 detik dengan kecepatan tinggi dalam microsentrifuge. 10. Sampel diinkubasi selama 30 menit pada suhu 95 o C dalam heating block. 11. Setelah selesai, sampel-sampel tersebut diaduk atau digoyang getar lagi secukupnya selama 15 detik dan sampel-sampel dispin (diputar) selama 20 detik dengan kecepatan tinggi dalam microsentrifuge.
14
12. Sampel siap digunakan untuk Reaksi PCR dan lebih baik jika disimpan dulu selama semalam dalam freezer.
3.3.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR) 1. Keluarkan reagen: ddH2O, dNTPs, buffer PCR, MgCI 2, Primer 1, dan Primer 2 dari freezer untuk mencairkan. 2. Mengisi formulir Hotstart PCR (24 µL) dengan mengisi tanggal, locus, primer, Nama, dan Spesies sampel. 3. Menghitung dan menggandakan volume dari protokol baku dalam formulir Hotstart PCR untuk membuat Master Mix (MM1 dan MM2) sebanyak jumlah sampel yang digunakan ditambah dengan dua buah kontrol dan dilebihkan satu untuk menghindari kekurangan pada saat digunakan. 4. Menandai dan menomori tabung PCR dalam rack, mengatur sampel sehingga berada dalam pola yang berhubungan dengan tabung PCR yang ditandai, serta mengatur tabung ekstra untuk kontrol. 5. Membuat campuran Master Mix (MM1) gunakan pipet NO DNA, tambahkan bahan sesuai dengan volume yang telah dihitung dalam daftar di lembar PCR di tabung 1.5 mL. Menggunakan tip berbeda untuk setiap penambahan reagen. Pipet naik dan turun untuk mencampur reagen sepenuhnya. 6. Menggunakan pipet NO DNA untuk membagi 14 µL MM1 ke dalam setiap tabung PCR dan menambahkan 1 µL DNA template (hasil ekstraksi) untuk setiap tabung. Sampel-sampel ini termasuk DNA ekstrak, control positif PCR dan control negative Chelex. Ambil dari atas setiap ekstrak Chelex karena tambahan butiran Chelex akan menghambat PCR. Selau mengganti tip baru untuk setiap sampel. 7. Mengambil Taq dari freezer. Mengunakan pipetteman Enzim, mengambil Taq sesuai dengan jumlah yang diinginkan dari bagian paling atas cairan. Mengembalikan Taq ke freezer. Dengan hati-hati menambahkan Taq ke MM2. Pipet naik turun untuk mencampur. mengamati hilangnya gliserol dalam larutan. 8. Memilih dan memulai program hot-star PCR. Membiarkan penutup panas dan menahan sebentar bila suhu mencapai 80° C. 9. Menempatkan strip tabung ke dalam mesin PCR (memastikan semua tertutup untuk mencegah penguapan reaksi PCR). 10. Dengan pipet DNA rendah, mengatur 10 µL pipetman, pipet naik turun MM2 untuk mencampur campuran master. Kemudian, dalam satu waktu, membuka tutup tabung, menambahkan MM2, pipet naik turun, dan menutup kembali. Mengulangi untuk setiap tabung dan mengganti tip untuk setiap sampel.
15
11. Memeriksa kembali untuk memastikan semuanya telah tertutup. Unpause program dan lihat layar mesin PCR untuk menjamin bahwa mesin PCR sedang bekerja. 12. Membersihkan tempat kerja, meletakkan reagen ke dalam freezer dan ekstrak DNA ke dalam lemari pendingin. 3.3.3 Elektroforesis 1. Membuat gel agarosa 2% dengan cara menyiapkan erlenmeyer, menimbang 0,8 gram agarosa dan memasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian menambahkan 40 ml TAE Buffer. 2. Memanaskan dalam microwave dan mengecek setiap menit serta mengaduk-aduk (dengan menggoyang-goyang erlenmeyer) hingga jernih. 3. Mengambil dan mengaduk lagi, kemudian menyiapkan cetakan agarosa dan sisir pembuat sumur. 4. Menuangkan gel agarosa ke dalam cetakan, dan meratakan serta memastikan tidak ada gelembung dan kotoran di dalam gel. Mendiamkan selama kurang lebih 30 menit sampat memadat. 5. Setelah dingin dan padat, melepar sisir dan memasukkan gel yang telah jadi beserta cetakanya ke dalam tangki elektroforesis yang telah bereisi buffer. 6. Mengambil parafilm, kemudian meneteskan loading dye di atas parafilm, kira-kira volumenya 1 µL. 7. Mengambil 4 µL DNA PCR produk, kemudian mencampurkan dengan loading dye, dan mengambil menggunakan pipet serta memasukkan ke dalam sumur gel nomor dua yang berada dalam tangki elektroforesis. 8. Setelah semua sampel selesai, memasukkan DNA ladder atau penanda pada sumur nomer 1 masing-masing baris, lalu tutup tangki tersebut. 9. Mensetting mesin pada voltase 200 V dan arus 72 mA dan waktu 15 menit, kemudian jalankan mesin. 10. Setelah selesai, ambil jel dan rendam selama 15 menit dalam larutan EtBr lalu cuci dengan ddH 2O. Selalu menggunakan sarung tangan berwarna biru dalam melakukan langkah ini. 11. Setelah selesai, mengambil jel dan meletakkan di atas box UV transluminator, kemudian tutup box kaca UV, dan nayalakan lampu UV. 12. Melihat adanya pita terang pada sampel yang positif mengandung DNA dan berhasil diamplifikasi dengan PCR. 13. Mengambil kamera dan memfoto gel, setelah itu membuang gel ke dalam box tempat pembuangan gel. 14. Membersihkan semua lokasi yang digunakan untuk bekerja.
16
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Praktikum 4.1.1 Ekstraksi DNA
Tabel 2. DNA Extraction Data Sheet Samples : Udang Galah Extraction Mthod : Chelex Tube Number Locality Type UGMK02 Merauke UGMK03 Merauke UGMK06 Merauke UGMK07 Merauke UGMK08 Merauke UGMK11 Merauke UGMK13 Merauke UGMK14 Merauke UGMK15 Merauke UGMK16 Merauke UGJA03 Jayapura
Date : 03 Desember 2013 PCR
Col Seq
Other
Supernatan/DNA template Chelex
(a)
(b)
Gambar 2. a. Sampel udang galah; b. Hasil ekstraksi DNA
4.1.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR)
Tabel 3. Perhitungan penggandaan Master Mix untuk: 7 tubes (Bidik Misi) STANDART PROTOCOL
( 1 µL of Template DNA) ddH2O 10 x PCR Buffer (PE-II) dNTPs (8 µM) MgCl2 (25 mM) Primer 1 foward (10 mM)
Total
MM1
MM2
14,5 2,5 2,5 2,0 1,25
5,5 1,5 2,5 2,0 1,25
9 1 ----
ACTUALPROTOCOL
( 1 µL of Template DNA) ddH2O 10 x PCR Buffer (PE-II) dNTPs (8 µM) MgCl2 (25 mM) Primer 1 foward (10 mM)
MM1
MM2
38,5 10,5 17,5 14 8,75
63 7 ----
17
Primer 2 reverse (10 mM) PE Amplitaq (5 units/µL) Total
1,25 0,125 24
1,25 -14
-0,125 10,125
Primer 2 reverse (10 mM) PE Amplitaq (5 units/µL) Total
8,75 -98
Gambar 3. Setingan Siklus Reaksi Polimerasi dalam Thelmal Cycler
Gambar 4. Hasil PCR 4.1.3 Elektroforesis
DNA Ladder
(a)
(b)
Gambar 5. Hasil elektroforesis produk PCR pada gel agarosa dilihat dengan sinar UV
4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini kami telah melakukan analisis DNA dari udang galah sebanyak 11 sampel, yang dibagi menjadi 7 sampel kelompok Bidik Misi dan 4 sampel kelompok umum. Rangkaian kegiatan dalam praktikum ini dimulai dari Ekstraksi DNA, Reaksi Berantai Polimerase (PCR) dan diakhiri dengan Elektroforesis.
18
-0,875 70,875
Ekstraksi DNA
Teknik ekstraksi yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah teknik Chelex. Teknik ini hanya dapat digunakan untuk persiapan PCR. Meskipun memiiiki keterbatasan, teknik ini unggul dalam hal cepat, murah dan efektif untuk ekstraksi DNA. Metode chelex disarankan untuk preparasi DNA karena tidak membutuhkan tabung-tabung untuk transfer. Metode ini cepat dan menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji kompleks PCR. Teknik Chelex umumnya mengeluarkan DNA untai tunggal menggunakan prosedur penambahan suspensi resin-chelat secara langsung untuk spesimen, kemudian melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen, magnesium. Dalam tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya. Tahap pertama prosedur ekstraksi DNA adalah memasukkan potongan jaringan sampel dengan ukuran seperti sebuah titik (.) ke dalam larutan Chelex. Pemotongan yang terlalu besar dapat menghambat reaksi. Setelah itu larutan dispin (diputar) dan dipanaskan dengan suhu 95 oC selama 30 menit. Pemanasan tersebut membantu memecahkan sel dan mendenaturasi protein. Seluruh kegiatan ekstraksi dilakukan dalam kondisi steril untuk menghindari kontaminasi. Selain itu, Chelex juga dapat melindungi sampel dari DNAse dan mencegah sampel dari kontaminan. Setelah pemanasan selesai, larutan dispin kembali dan akan menghasilkan larutan dalam dua fraksi, yaitu fraksi bagian atas merupakan supernatan yang mengandung DNA dan fraksi bawah merupakan endapan Chelex. Supernatan tersebut merupakan bagian yang akan digunakan dalam reaksi PCR.
Reaksi Polimerase Berantai (PCR)
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. PCR adalah teknik in vitro yang dapat mengamplifikasi bagian DNA spesifik yang terletak di antara dua bagian DNA yang telah diketahui. PCR merupakan teknik biokimia dan biologi molekuler untuk isolasi dan amplifikasi secara eksponensial fragmen atau urutan sasaran DNA melalui replikasi enzimatik, atau tanpa menggunakan mahluk hidup (seperti E. coli atau ragi).
19
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu Thermo Cycler . Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target disebut forward dan yang berada setelah daerah target disebut reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR diperlukan dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasis Adenin), dCTP (Cytosine), dGTP (Guanine) dan dTTP (Thymine). Dalam satu tube reaksi PCR harus mengandung beberapa komponen, yaitu DNA template (sampel hasil ekstraksi) 1 µL dan komponen campuran 24 µL, sehingga dalam satu tube volume total yang dibutuhkan adalah 25 µL. Komponen-komponen campuran tersebut antara lain ddH 2O 14,4 µL, 10 x PCR Buffer (PE-II) 2,5 µL, dNTPs (8 µM) 2,5 µL, MgCl 2 (25 mM) 2 µL, Primer forward (10 mM) 1,25 µL, Primer reverse (10 mM), dan PE Amplitaq (5 units/µL) 0,125 µL. Komponen ddH 2O merupakan air steril atau air yang bebas molekul. Dalam
reaksi PCR, dibutuhkan buffer sebagai penyangga reaksi.
Deoxyribonukleat Tri Phospat (dNTPs) merupakan komponen yang penting dalam berjalannya reaksi PCR. Kedua primer digunakan untuk menginisiasi reaksi PCR dari ujung 3’ ke 5’ dan sebaliknya. Yang paling penting dalam reaksi PCR adalah enzim polymerase, contohnya PE Amplitaq. Dalam mengerjakan reaksi PCR, selain sampel juga dibutuhkan suatu DNA control positif dan DNA control negatif. DNA control positif merupakan suatu DNA template yang sebelumnya telah berhasil dikerjakan dalam reaksi PCR, sedangkan DNA control negatif merupakan hasil ekstraksi yang tidak mengandung sampel yang digunakan untuk mengetahui adanya kontaminan antar sampel. Selain itu komponen-komponen PCR harus dipisahkan dalam bentuk 2 buah Master Mix, yaitu MM1 dan MM2 untuk memudahkan langkah pengerjaan PCR. Pemisahan ini harus dihitung dengan mengalikan jumlah tube yang
20
diinginkan dengan faktor perkalian yang telah ditentukan pada MM1 dan MM2. Hal ini tergantung metode PCR yang digunakan. Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi (pemanjangan). Sesuai profil yang digunakan seperti dalam gambar 3, proses berjalanya siklus PCR dalam Thermal Cycler dapat dijelaskan sebagai berikut. Langkah awal proses didahului dengan tahap pradenaturasi yaitu pemanasan sampai suhu 80o C. Pada suhu 94 o C, molekul DNA mengalami denaturasi sehingga struktur berubah dari untai ganda menjadi untai tunggal. Pada suhu berkisar antara 50 o C, primer forward yang runtutan nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu untai tunggal akan menempel pada posisi komplemennya. Demikian juga primer reversenya akan menempel pada untai tunggal lainnya. Proses ini disebut annealing. Setelah kedua primer tersebut menempel pada posisinya masing-masing enzim polymerase mulai mensintesis molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 3’ nya masing -masing primer pada suhu 72o C. Proses ini disebut ekstensi/pemanjangan. Dengan demikian, satu molekul DNA ganda akan berlipat jumlahnya menjadi dua molekul DNA.
Setelah
itu
proses
denatuasi,
penempelan
(annealing),
ekstensi
(pemanjangan) tersebut diulangi sebagai suatu siklus. Dalam proses PCR yang telah kami lakukan, siklus tersebut diulang sebanyak
38 siklus. Hasil PCR
tersebut kemudian diverifikasi keberhasilannya menggunakan elektroforesis.
Elektroforesis
Pada praktikum elektroforesis kali ini digunakan gel agarose, karena dengan menggunakan gel agarose teknik yang digunakan cukup sederhana, dan mudah penanganannya. Selain itu gel agarose mempunyai kemampuan pemisahan dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70 pb (pasangan basa) sampai 800.000 pb. Penggunaan gel agarose juga mempunyai keuntungan, dimana lokasi dari DNA dalam gel dapat diamati secara insitu dengan menggunakan Ethidium Bromida (EtBr) sebagai pewarna. EtBr nantinya akan berinteraksi dengan basa dari molekuk DNA dan memberikan warna orange Floresance dibawah lampu UV. Hasil penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-pita DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen.
21
Elektroforesis
dengan
Agarose
merupakan
metode
standar
untuk
memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anoda). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar ( DNA ladder ) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu direndam di dalam larutan EtBr sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. Dalam proses elektroforesis yang telah dilakukan, sampel molekul DNA yang telah dicampur dengan larutan loading dye ditempatkan ke dalam sumur ( well ) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan li strik dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan ( staining ) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dideteksi. Dalam praktikum ini kami menggunakan Etidium bromida sebagai zat pewarnanya. Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet, apabila proses PCR berhasil maka akan terlihat pita-pita (band ) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel. Satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. Penanda ( marker ) atau DNA ladder yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan mengelektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
22
BAB V PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkahlangkah kerja analisis DNA. Teknik Chelex adalah metode ekstraksi yang cepat dan efektif menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji kompleks PCR. Teknik Chelex mengeluarkan DNA untai tunggal menggunakan prosedur penambahan suspensi resin-chelat secara langsung untuk spesimen, kemudian melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen, magnesium. Dalam tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya yang menghasilkan larutan dalam dua fraksi, yaitu fraksi bagian atas merupakan supernatan yang mengandung DNA dan fraksi bawah merupakan endapan Chelex. PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu Thermo Cycler . Dalam satu tube reaksi PCR harus mengandung beberapa komponen, yaitu DNA template (sampel hasil ekstraksi) 1 µL dan komponen campuran antara lain ddH2O 14,4 µL, 10 x PCR Buffer (PE-II) 2,5 µL, dNTPs (8 µM) 2,5 µL, MgCl 2 (25 mM) 2 µL, Primer forward (10 mM) 1,25 µL, Primer reverse (10 mM), dan PE Amplitaq (5 units/µL) 0,125 µL. Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi/pemanjangan dengan pengulangan sebanyak kurang lebih 38 siklus. Elektroforesis
dengan
Agarose
merupakan
metode
standar
untuk
mengidentifikasi atau memverifikasi keberhasilan reaksi PCR molekul DNA. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anoda). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen
23
molekul DNA standar ( DNA ladder ) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu direndam di dalam larutan EtBr sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.
5.2 Saran
1. Sebaiknya langkah-langkah kegiatan praktikum harus dilakukan dengan tepat
dan
sangat
hati-hati
karena
kesalahan
yang
terjadi
dapat
mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil. Hal ini terutama dalam penggunaan bahan harus sesuai dengan aturan yang telah ditentukan dalam petunjuk kegiatan praktikum. 2. Seluruh kegiatan analisis DNA harus dilakukan secara aseptis dan steril agar tidak terjadi kontaminasi yang dapat mempengaruhi hasil reaksi. 3. Praktikan harus berhati-hati saat melakukan perendaman dalam EtBr dan visualisasi dengan sinar UV, karena kedua hal tersebut sangat berbahaya bagi kesehatan apabila dilakukan dengan ceroboh.
24
DAFTAR PUSTAKA
Anam K. 2010. Isolasi dan Pemetaan DNA Plasmid . Bogor : Bioteknologi Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Binur, Robi. 2013. Panduan Praktikum Biologi Molekuler . Manokwari: Jurusan Biologi FMIPA UNIPA Fatchiyah dkk. 2012. Buku Praktikum Teknik Analisis Biologi Molekuler . Malang: Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler FMIPA Universitas Brawijaya. Handoyo, Darmo dan Ari Rudiretna. 2000. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction. Surabaya: Pusat Studi Bioteknologi. Universitas Surabaya. Jusuf, Muhammad. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Bandung: ITB. Juwita dan Sinaga, Rika Nailuvar. 2012. Laporan Praktikum Isolasi DNA dan Teknik PCR. Medan : USU Resepstory. Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Geneitika. Bogor : IPB Press Maulana, Ridwan. dkk. 2010. Isolasi DNA Tanaman dan Elektroforesis DNA. Jakarta: Jurusan Pendidikan Biologi FMIPA UPI Prasetyoputri, Anggia. 2005. Bengkel Ilmu Genetik . Jakarta: Erlangga. Sutomo, Juanda. 2002. Genetika Lanjutan Universitas. Jakarta: Erlangga. Walsh, PS, Mezger, D.A., Higuchi, R. 1991. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material . Biotechniques.
25
