PCR

TEHNIK ANALISIS BIOMOLEKULER

“PCR”

Oleh:

Farras Shanda

105130103111003

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

Polymerase Chain Reaction atau yang biasa disebut PCR adalah metode untuk amplifikasi (memperbanyak) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram dari DNA template. Proses ini mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.Polymerase Chain Reaction (PCR) ini dapat digunakan untuk amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi, pada bidang kedokteran forensik dan melacak asalusul sesorang dengan membandingkan “finger print”. Kemudian tahapan dari PCR ini yaitu 1) Denaturasi Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 oC – 95 oC. Durasi tahap ini 1–2 menit. 2) Penempelan primer Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 oC – 60 oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 oC. Durasi tahap ini 1–2 menit. 3) Reaksi polimerisasi (extension) atau Perpanjangan Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72 oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi

3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Adapun macam-macam tipe dan modifikasi dari PCR adalah sebagai berikut: a. Real-Time PCR Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR. Dimana teknik ini digunakan untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real time PCR memungkinkan dilalukan deteksi dan kunatifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sequens spesifik dari sampel DNA yang dianalisis. Pada analisa PCR konversional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe(penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforensis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik. Cara kerja dari Real Time mengikuti prinsip umum reaksi PCR, utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. b. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Reverse Transcriptase-PCR juga sering dikenal dengan kinetic polymerase chain reaction. RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR, dimana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Pada metode PCR biasa sumber sampel yang digunakan adalah DNA yang diekstrak dari sel atau jaringan. Pada RT-PCR sampel yang digunakan bukan DNA melainkan RNA. Sebagaimana kita ketahui, RNA merupakan asam ribonukleat rantai tunggal, sedangkan DNA adalah asam ribonuleat rantai ganda. Ciri khas RNA adalah tidak terdapat gugus basa timin (T) melainkan diganti oleh urasil (U). Proses RT PCR dibantu oleh enzim Reverse Transcriptase, karena hanya enzim jenis ini yang dapat mensintesis DNA dengan cetakan RNA karena polimerase DNA hanya dapat mensintesis dengan menggunakan cetakan DNA. Pertama-tama RNA diubah dulu menjadi

DNA dengan menggunkan enzime reverse transcriptase yang disebut dengan komplemen DNA (cDNA) . dalam hal ini disintesis cDNA dari perpasangan anatar gugus basa U dan A serta G dan C. Dari cDNA inilah dilipat gandakan segemn DNA yang mirip urutan basa nukleotidanya dengan RNA, hanya U diganti kembali ke T. Karena adanya penambahan proses sintesis cDNA, tahapan proses PCR bertambah pula. Tahap pertama terjadi proses anneling untuk memasangkan primer untuk memperpanjang segmen cDNA. Setelah terbentuk segmen cDNA ini, baru kemudian masuk kepada proses PCR biasa. RT-PCR peting digunakan sebagai alat diagnostik untuk mendeteksi dan menentukan serotipe virus, sebagai informasi untuk studi epidemiologi. c. Nested PCR Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi. Nested PCR dan PCR biasa berguna untuk memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak. Dimana pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena itu hasil fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR. Selain itu, keuntungan nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer. Mekanisme kerja dari nested PCR sendiri yakni pada Fase Denaturasi, Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan. Fase Penempelan, sepasang primer pertama melekat di kedua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama. Fase pemanjangan, produk PCR pertama tersebut dijalankan pada proses PCR kedua di mana pasangan primer kedua (nested primer) akan mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi bagian di antara kedua primer tersebut. Hasilnya adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR pertama. d. Multiplex-PCR

Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel . e. PCR-ELISA PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR. PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telah berkembang untuk mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sequen tersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara beberapa sasaran dari sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini juga berguna untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah sampel tidak menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISA adalah kemampuannya dalam membedakan antara produk reaksi perubahan polimerase yang dihasilkan dari seperangkat primer yang mengandung variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer.

Resume jurnal Judul jurnal: Development of a real-time RT-PCR for the detection of Swinelineage Influenza A (H1N1) virus infections Judul: Pengembangan real-time RT-PCR untuk mendeteksi infeksi sebuah Virus pada garis keturunan Flu Babi A (H1N1)

Dalam jurnal tersebut dijelaskan bahwa influenza virus A, subtipe H1N1 yaitu virus dari babi-garis keturunan (H1N1 SWL) telah menyebar dengan cepat ke berbagai daerah di dunia dengan bukti penularan berkelanjutan dalam beberapa negara.

Kemudian

untuk

itu

diperlukan cepat

untuk

mendeteksi

dan

mendiferensiasi virus influenza tersebut , karena untuk kesehatan masyarakat dan manajemen untuk pengawasan penyakit itu sendiri. Nah untuk itu penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan real-time transcriptase polymerase reaksi cepat dan sensitif rantai terbalik (RtRT-PCR) untuk konfirmasi dari virus H1N1 SWL tersebut. Cara dari penelitian ini yaitu dengan langkah menggunakan rtRT-PCR untuk menargetkan gen matriks dari novel influenza H1N1 SWL dan divalidasi terhadap sebuah panel influenz A (H1N1 dan H3N2), flu babi H1N1 dan influenza A/H5N1 virus burung. Validasi berikut assay ini kemudian digunakan secara prospektif untuk mendeteksi H1N1 spesimen SWL positif dari wabah terbaru di Inggris dan Republik Irlandia tersebut. Hasil dari satu penelitian H1N1 SWL matriks dengan menggunakan rtRT-PCR berhasil mendeteksi H1N1 spesimen SWL klinis dan tidak bereaksi silang dengan influenza musiman A, subtipe H1N1 dan virus H3N2 dan influenza babi A (H1N1). H1N1 SWL uji matriks tidak bereaksi silang dengan H5N1. Lalu H1N1 SWL uji matriks kemudian dibandingkan dengan dua tes lainnya yaitu menggunakan serangkaian pengenceran dan panel dari influenza A untyped klinis yaitu dengan diambil sampel positifnya. Jadi Hasil ini menunjukkan bahwa rtRT-PCR sensitif atau lebih cepat dan bisa diterapkan pada universal influenza A untuk mendeteksi virus H1N1 SWL, yaitu subtipe H1N1 dari virus babi yang berasal dari garis keturunan.