LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DASAR KI-3261 METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK Percobaan 9 ISOLASI GEN 16S rDNA DENGAN TEKNIK PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
Nama
: Nisrina Rizkia
NIM
: 10510002
Kelompok
:6
Tanggal Percobaan
: 11 April 2013
Tanggal Laporan
: 15 April 2013
Asisten Praktikum
: Ka Fean
LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2013
ISOLASI GEN 16S rDNA DENGAN TEKNIK PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
I.
Tujuan a. Mengisolasi dan memperbanyak fragmen gen 16S rDNA dari koloni tunggal dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). b. Menentukan massa molekul fragmen gen 16S rDNA dengan metode elektroforesis gel agarosa.
II.
Dasar Teori Gen 16S rDNA adalah suatu gen yang mengkode 16 rRNA yaitu suatu komponen 30S dari ribosom. Isolasi gen 16S rDNA dilakukan dengan mengamplifikasi urutan nukleotida
gen
dengan
teknik
PCR.
Polymerase
Chain
Reaction
(PCR) adalah suatu teknik in vitro yang dapat mengamplifikasi bagian DNA tertentu yang berada di anatra dua bagian urutan DNA. Amplifikasi DNA dengan PCR dapat dilakukan menggunakan primer oligonukleotida atau disebut juga amplimer. Primer ini adalah suatu molekul DNA untai tunggal pendek yang berkomplemen dengan ujung urutan DNA templat. Primer akan diperpanjang pada DNA templat oleh DNA polymerase dengan keberadaan deoksinukleosida trifosfat (dNTPs). Proses ini akan menghasilkan rantai DNA baru yang berkomplemen dengan rantai templat sehingga menghasilkan rantai DNA untai ganda baru. Sintesis rantai DNA dapat diulang melalui proses denaturasi termal molekul NA untai ganda, penempelan primer pada DNA dan perpanjangan primer oleh DNA polimerase pada temperatur yang sesuai dengan kerja enzim.
III.
Data Pengamatan
Gambar 1. Hasil elektroforesis menggunakan gel agarosa IV.
Perhitungan dan Pengolahan Data
Gambar 2. Marker DNA
Gambar 3. Pita yang dihasilkan dari marker
V.
Pembahasan Pada percobaan dilakukan isolasi dan memperbanyak fragmen gen 16S rDNA dari
koloni tunggal dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). 16S rDNA adalah subunit ribosom yang dapat digunakan sebagai pembeda, penanda dan sebagai tanda evolusi pada bakteri. Molekul ini dapat berubah sesuai dengan waktu evolusinya sehingga dapat digunakan sebagai krnometer evolusi yang baik. Molekul 16S rDNA memiliki susunan basa yang relatif konservatif dan juga variatif. Urutan basa yang variatif ini dapat digunakan untuk mengetahui keragaman galur-galur dalam satu spesies (UPI). Gen 16s rDNA yang diisolasi berasal dari E. coli yang memiliki jumlah pasang basa sekitar 1500. E. coli merupakan salah satu bakteri yang termasuk bakteri gram negatif. Gram negatif adalah bakteri yang akan berwarna merah atau merah muda ketika proses pewarnaan gram, sedangkan gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna violet ketika proses pewarnaan gram (Madigan, 2006). Bakteri gram positif mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal yaitu peptidoglikan dan sisanya adalah asam teikhoat. Sedangkan gram negatif memiliki system membran ganda yang mana membrane plasma diselimuti oleh membrane luar permeable. Dinding yang tebal merupakan akibat adanya peptidoglikan yang terletak di antara membrane dalam dan membrane luar. PCR adalah teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang dikembangkan oleh Karry Mullis. Dengan menggunakan teknik ini dapat pula dilakukan amplifikasi segmen DNA dalam julah jutaan kali hanya dalam beberapa jam (Handoyo, 2000). Daerah yang diperbanyak dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Pada teknik ini dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan yang mengandung DNA target untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polierase, deoksinukleosida trifosfat (dNTPs) dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase akan mengkatalisis pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan DNA templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan fosfat pada 5’ DNTP yang ditambahkan. Oleh karena itu, proses penambahan DNTP berlangsung dengan arah 5’ ke 3’.
Dalam prosesnya PCR melibatkan beberapa teknik yaitu yaitu pre-denaturasi DNA templat, denaturasi DNA templat, penempelan primer, pemanjangan primer, pemantapan (postextension). Tahap kedua hingga keempat merupakan tahapan berulang (siklus). Denaturasi atau pemisahan ikatan untai ganda DNA dilakukan dengan menaikkan suhu pada 95-98oC sehingga dihasilkan dua untai tunggal DNA. Apabila dalam DNA target mengandung banyak nukleotida G atau C, suhu denaturasi dapat ditingkatkan. Dua untai DNA yang dihasilkan ini akan digunakan sebagai templat. Penempelan primer terjadi pada kondisi suhu yang diturunkan menjadi 37-50oC tergantung dari DNA yang digunakan. Penurunan suhu ini berfungsi untuk mengikatkan primer dengan untai tunggal DNA templat yang berkomplemen dengan primer tersebut. Perpanjangan primer dengan memanfaatkan DNA polimerase, enzim ini dapat mensintesis komplemen dari untai tunggal DNA dari ujung 3’ yang didahului dengan proses penempelan primer. Pada tahap ini suhu dinaikkan hingga 72oC. Akhir dari siklus pertama ini adalah dihasilkan dua untai ganda DNA (Giasuddin, 1995). Proses dalm teknik PCR tersebut dapat dilihat pada gambar 4 dan 5. Pada percobaan ini tahapan reaksi PCR digunakan suhu 95 oC sebagai suhu pre denaturasi
untuk menyakinkan bahwa molekul DNA target yang ingin dilipatgandakan
jumlahnya benar-benar terdenaturasi. Kemudian 48 oC untuk anneling dan 72 oC untuk pemanjangan rantai primer. Sedangkan suhu 95 oC yang kedua adalah suhu untuk memisahkan untai ganda DNA pada siklus-siklus selanjutnya dan 72 oC yang kedua adalah untuk mengecek kembali urutan basa DNA ketika polimerisasi berjalan. Jumlah kopi fragmen DNA (amplikon) yang dihasilkan dengan menggunakan teknik PCR ini dapat ditentukan dengan perumusan: Y = ( 2n – 2n)X X = jumlah molekul DNA templat awal n = jumlah siklus Y = jumlah amplikon
Gambar 4. Tahapan pada PCR
Gambar 5. Tahapan PCR beberapa siklus
Dalam melakukan percobaan dengan teknik PCR ini digunakan beberapa reagen yaitu DNA templat,primer maju (BactF1), primer mundur (UniB1), ddH2O, dream Taq polymerase, dNTP dan Buffer dream Taq polymerase. DNA templat sebagai cetakan dalam pembentukan molekul DNA baru, DNA templat ini dapat diperoleh dengan menggunakan metode lisis sel adalah perusakan dinding sel namun tanpa merusak DNA yang menjadi target. Dalam percobaan yang dilakukan lisis sel dilakukan dengan penambahan air, pemanasan dan pengadukan secara makanik. Namun tidak hanya itu, metode lisis juga dapat dilakukan dengan menggunakan buffer lisis, komposisi yang digunakan tergantung pada jenis sampel. Contoh buffer lisis adalah buffer K yang memiliki komposisi buffer PCR (50mM KCl, 1020mM Tris-Cl dan 2,5mM MgCl2); 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K. Cara lain adalah isolasi DNA kromosom atau plasmid adalah dengan memecah dinding sel kemudian DNA kromosom atau plasmid dipisahkan dari komponen lain sehingga memiliki kemurnian yang tinggi (Handoyo, 2000).
Primer yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah primer maju (BactF1) dan primer
mundur
(UniB1).
Primer
mundur
(Uni
B1)
memiliki
urutan
5'-
GGTTAC(G/C)TTGTTACGACTT-3' dan primer maju (BactF1) memiliki urutan 5'AGAGTTTGATC(A/C) TGGCTCAG-3' (Nurachman, 2010). Primer ini akan menempel pada ujung untai tunggal DNA templat. Setelah itu primer akan mengalami polimerisasi dari tempat penempelannya pada 3’ ke 5’ DNA templat. Sehingga pada akhirnya akan diperoleh dua pasang untai ganda DNA apabila DNA templat sebelumnya berupa sepasang untai DNA. Untuk proses penempelan primer perlu ada perancangan terlebih dahulu, apabil urutan DNA yang dituju belum diketahui maka dapat dilakukan analisis homologi dari urutan DNA yang memiliki kekerabatan terdekat. Perancangan primer harus memenuhi beberapa kriteria yaitu panjang primer, komposisi primer, titik leleh (Tm). Primer yang digunakan biasanya berkisar 18-30 basa. Apabila digunakan primer yang pendek maka kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan primer pada tempat yang salah) akan tinggi yang akan mempengaruhi efisiensi proses PCR, sedangkan bila digunakan primer panjang (lebih dari 30 basa) tidak akan meningkatkan spesifisitas primer. Dalam perancangan primer hindari untuk urutan nukleotida yang sama secara terus menerus karena dapat menurunkan spesifisitas primer selain itu sebaiknya kandungan (G+C)) (% jumlah G dan C) sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Tm adalah temeperatur ketika 50 % untai ganda DNA terpisah. Tm akan berpengaruh dalam proses anneling sehingga sangatlah penting pemilihan Tm suatu primer. Secara teoritis Tm dapat ditentukan dengan menggunakan rumus [2(A+T) + 4(C+G)], suhu anneling berada pada rentang (Tm-5)oC sampai dengan (Tm+5)oC (Handoyo, 2000). Dalam percobaan ini digunakan ddH2O (aqua bidestilasi atau ultrapure water) namun sebenarnya juga dapat menggunakan buffer TE yang merupakan campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. Keduanya dapat dilakukan untuk melarutkan DNA atau RNA. DNA akan lebih stabil apabila dilarutkan dalam TE buffer karena dijaga pada pH 8. Jika menggunakan ddH2O akan menimbulkan perubahan PH karena DNA memiliki sifat asam lemah dan dapat menyebbakan degradasi DNA. Namun, dalam kasus penggunaan PCR ddH2O lebih unggul karena tidak mengandung chelating agent,
sedangkan TE buffer mengandung EDTA yang dapat berkompleks dengan ion Mg2+ sehingga mengganggu kerja enzim Taq polymerase (Sciencebiotech, 2010). Enzim polimerase DNA yang digunakan dalam percobaan ini adalah dream Taq polymerase yang diisolasi dari bekteri Thermus aquaticus. Enzim ini berfungsi sebagai katalis untuk reaksi polimerisasi DNA. Enzim yang digunakan untuk PCR berasal dari bakteri termofilik dan hipertermofilik sehingga bersifat termostabil sampai temperature 95oC. Aktivitas polimerase bergantung dari jenisnya, contohnya saja Pfu polymerase yang mempunyai aktivitas 10 kali lebih besar dibandingkan dengan aktivitas spesifik enzim Taq polymerase. Panjang fragmen DNA yang dapat diamplifikasi dapat mencapai 35 kilo basa. Untuk mengamplifikasi fragmen DNA yang panjang diperlukan enzim polimerase yang memiliki aktivitas besar (Handoyo, 2000). Enzim ini memiliki massa molekul 63-68 kDa yang memiliki 832 asam amino, N terminal adalah metionin dan C terminal adalah glutamin. Enzim ini memiliki 3 domain domain nuclease 5’ ke 3’ , domain tidak aktif eksonuklease dari 3’ ke 5’ dan domain polimerase dari 5’ ke 3’. Domain polimerase dan domain eksonuklease disebut Klentaq fragment. Enzi mini terlihat seperti tangan kanan dengan palm, fingers, dan thumb bagian palm mengkatalis transfer gugus fosforil, bagian fingers berinteraksi dengan nukleosida trifosfat dan templat. Dan bagian thumb membantu memposisikan DNA dan enzim sepanjang untai DNA templat. Struktur Taq polymerase terlihat pada gambar 6.
Gambar 6. Taq Polymerase Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) terdiri dari dATP, dTTP, dCTP dan dGTP yang bertindak sebagai building block DNA dan diperlukan dalam proses perpanjangan.
dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer dan memebentuk untai baru yang berkomplemen dengan untai DNA templat (Handoyo, 2000). Buffer dream Taq polymerase berfungsi untuk menjaga pH medium karena reaksi dalam PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Pada percobaan ini juga ditambahkan MgCl2 karena untuk menstimulasi aktivitas DNA polimerase membutuhkan Mg2+ sebagai kofaktor yang berikatan dengan sisi aktif dari enzim yaitu gugus karboksilat pada residu aspartat. Interaksi primer dengan templat akan meningkat dan membentuk kompleks yang larut dengan dNTP (Handoyo, 2000). Setelah proses PCR maka selanjutnya adalah elektroforesis agarosa untuk memastikan isolasi DNA yang dilakukan berhasil dan harapannya akan dihasilkan satu spot saja dan tentunya massa molekulnya dapat ditentukan melalui perbandingan dengan marker DNA. Untuk memisahkan DNA digunakan gel agarosa karena memiliki ukuran pori yang besar sehingga dapat dilewati oleh DNA. Molekul DNA akan bergerak menuju arah elektroda positif karena molekul DNA bermuatan negatif dari gugus fosfat yang dimilikinya. EtBr yang ditambahkan saat pembuatan gel agarosa berfungsi untuk memvisualisasikan pita DNA karena akan terlihat pendarannya di bawah sinar UV hal itu disebabkan EtBr berada di antara basa nukleotida.
Buffer TAE elektroforesis berfungsi untuk penghantar listrik karena
memiliki daya ion dalam larutan. Sedangkan buffer TAE pada pembuatan gen agarosa adalah untuk menjaga pH, elektrolit gram (asam asetat) dan untuk menonaktifkan DNA (EDTA). Larutan pemberat (bromfenol biru 0,1% (b/v) dan sukrosa 40% (b/v)) digunakan untuk menjaga agar sampel tidak turun dari sumur. Terdapat kontrol negatif dengan menmbahkan ddH2O dan kontrol positif dengan menambahkan DNA kromosom. Kontrol negatif berfungsi untuk mengetahui kondisi reagen sehingga pada hasil elektrolisis seharusnya kita tidak mendapatkan pita DNA. Kontrol positif berfungsi untuk mengetahui pita yang merupakan pita DNA sampel karena DNA kromosom yang digunakan sudah diisolasi sebelumnya sehingga seharusnya pada hasil elektroforesis kita akan mendapatkan pita. Pada control negatif memang tidak dihasilkan pita namun pada kontrol positif pun tidak dihasilkan pita DNA. Dari hasil elektroforesis agarosa tidak didapatkan pita DNA sampel (lihat gambar 1), namun untuk marker muncul 14 pita sesuai dengan apa yang terdapat pada referensi. Hal tersebut dapat dikarenakan lisis sel yang dilakukan memberikan hasil yang tidak maksimal,
mungkin saja suhu yang digunakan dan pengadukan secara mekanik yang dilakukan kurang optimum sehingga sel tidak terlisis dengan baik dan DNA tidak dihasilkan. Selain itu, kemungkinan lain adalah denaturasi untai ganda DNA yang tidak lengkap sehingga menyebabkan renaturasi secara cepat. Kegunaan PCR dalam kehidupan di antaranya yaitu dapat digunakan untuk mengidentifikasi padi bermutu rasa tinggi, beras Rojolele dan Koshihikari dapat dibedakan dengan teknik PCR. Pengulangan dan validasi penanda molekular diperlukan untuk mendapat profil sidik jadi dari setiap varietas. Penanda molekula ini dilakukan untuk kemurnian beras Rojolele (Lestari, 2011). Manfaat lain dari PCR adalah pertama dalam hal evolusi suatu makhluk hidup misalnya saja untuk melihat genetika hewan masa lalu yang sekarang telah punah maupun mengetahui hewan-hewan yang terancam punah. Populasi yang terancam punah dapat dicegah dengan melakukan identifikasi menggunakan teknik PCR.. Kedua, PCR dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi gen contohnya saja mengetahui penyakit
-
talasemia, fenilketonuria, anemia. Ketiga, mendeteksi mikroorganisme patogen, PCR dapat mendeteksi virus yang menyebabkan kanker misalnya saja Limfoma Burkitt. Bakteri patogen yang terdeteksi oleh PCR adalah Mycobacterium, Vibrio, Treponema dan Chlamydia. Keempat, manfaat untuk lingkungan, PCR dapat mendeteksi keberadaan bakteri yang dilepaskan ke lingkungan, hal ini dapat menjadi digunakan untuk mengidentifikasi kualitas air (Giasuddin, 1995). VI.
Kesimpulan Isolasi dan perbanyakan fragmen gen 16S rDNA dari koloni tunggal dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) tidak berhasil dilakukan karena tidak dihasilkan pita DNA, sehingga massa molekul dari DNA tersebut tidak dapat ditentukan.
VII. Daftar Pustaka A. S. M. Giasuddin. 1995. Polymerase Chain Reaction Technique: Fundamental Aspect and Applications in Clinical Diagnostics. Journal of ISLAMIC Academy of Sciences 8:1, 29-32.
Handoyo, Darmo. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Pusat Studi Bioteknologi Universitas Surabaya. Unitas, Vol.9 halaman 1729. http://sciencebiotech.net/te-buffer-vs-ddh2o/ (diakses tanggal 14 April 2013) http://repository.upi.edu/operator/upload/s_bio_0708783_chapter1.pdf
(diakses
tanggal 14 April 2013) Lestari, Puji. 2011. Metode PCR (Polymerase Chain Reaction) Cara Mengidentifikasi Padi Bermutu Rasa Tinggi. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber daya
Genetik Pertanian. Edisi 16-22 Maret 2011
No.3397 Tahun XLI, hal. 13-16. Madigan MT, Martinko JM, Brock TD. 2006. Brock Biology of Microorgnisms. New Jersey: Pearson Prentice Hall. Zeily Nurachman, Alfredo Kono, Ocky Karna Radjasa, Dessy Natalia. 2010. Identification a Novel Raw-Starch-Degrading-α-Amylase from a Tropical Marine Bacterium. American Journal of Biochemistry and Biotechnology 6 (4): 300-306
