“Reacción en cadena de la polimerasa y subtipos”
Alumnos: Francisca Francisca Cárcamo Cárcamo Profesor: Solange Rivas Natalia Landeros Asignatura: Asignatura: Citogenética Citogenética Fecha: 3 de Octubre del 2017
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Es una técnica que es capaz de generar cantidades ilimitadas de una secuencia que deseamos estudiar. Entonces, la PCR es capaz de amplificar una secuencia especifica de DNA o RNA millones de veces.
Esta técnica, consta de tres etapas: 1. Desnaturalización: Consiste en separar las dos hebras del ADN por medio de temperatura, aproximadamente a 94°c. 2. Hibridación o alineamiento: Proceso en el cual se unen los cebadores a sus secuencias complementarias. Los cebadores, hibridan específicamente, es decir, se unen a las dos hebras complementarias del segmento de ADN el cual deseamos amplificar. 3. Extensión : También se le llama síntesis del ADN, en la cual la enzima ADN polimerasa, trifosfatos de desoxirribonucleótidos alarga los cebadores, incorporando los desoxinucleótidos cuyas bases son complementarias a las de la hebra que le sirve de molde. La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’.
La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al final del ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por el número total de pares de bases que deberá ser conocido por el investigador.
En la técnica de PCR, se realizan entre 20 a 30 ciclos, y con esto se pueden obtener varios millones de copias de secuencias o fragmentos de DNA.
Finalmente, para lograr una correcta visualización, los amplicones son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa.
Esta técnica, podría ser utilizada para el diagnóstico de la fibrosis quística.
RT-PCR:
También denominada PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR, reverse transcriptase PCR ). Lo primero es la síntesis de un cDNA de cadena única a partir
del mRNA de interés con la misma transcriptasa inversa utilizada para preparar genotecas de clones de cDNA. Luego se añaden cebadores de PCR y DNA polimerasa, como en el caso de la PCR para DNA. Uno de los oligonucleótidos ceba la síntesis de la segunda cadena de cDNA que, en su forma de doble cadena, sirve como diana para la amplificación con PCR. Esta técnica, se puede utilizar para la Detección de secuencias del gen BCR-ABL mediante RT-PCR en pacientes con leucemia
PCR cuantitativa:
Técnica que determina en tiempo real el incremento en la cantidad del producto PCR generado durante la reacción PCR.
El objetivo de la PCR en tiempo real es detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes en la reacción.
El fundamento de esta técnica se basa en la PCR punto final, sólo que la forma en cómo se detectan y analizan los productos de la amplificación es diferente. El término en tiempo real se refiere a que la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción. Además, el término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra, a
diferencia de la PCR punto final en donde no es posible detectar en tiempo real ni cuantificar la secuencia blanco.
La PCR cuantitativa, se puede utilizar para el diagnóstico de las Leucemias.
PCR-multiplex:
También denominadas PCR múltiples (multiplex-PCR o mPCR), son reacciones que consiguen amplificar simultáneamente en un único tubo, es decir, una única reacción a diferentes secuencias diana. A menudo, esta variación de la PCR se utiliza en microbiología, y específicamente se puede utilizar para la detección de enfermedades de transmisión sexual.
PCR-RFLP
Es un tipo de PCR, llamada técnica de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP).
Esta Técnica se basa en el corte con endonucleasas de restricción de los productos amplificados por PCR. Si dos amplicones presentan una variación de la secuencia nucleotídica, en los sitios de reconocimientos de las enzimas de restricción, generarán distintos patrones de fragmentos.
Un posible diagnostico a una patología o mutación genética, es la determinación de CYP3A4*1B mediante PCR-RFL en la susceptibilidad del cáncer de mamas.
Nested-PCR
También conocidad como PCR anidada, variante de la PCR convencional que trata de dos rondas de amplificación con distintos pares de cebadores en cada una, y que tiene por objetivo aumentar la sensibilidad y la especificidad de la detección. -
Primero se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el segmento diana.
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Posteriormente, este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica
Esta técnica, se puede utilizar para el gen VHE.
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