Polymerase chain reaction (PCR)
(Diajukan guna memenuhi tugas mata kuliah Genetika SP)
Disusun oleh: FENTI RI RIADIYATI
(11021010300)
!"I FADI#A$
(11021010303%)
PR&'RA" T!DI PENDIDIAN *I&#&'I +!R!AN PENDIDIAAN "IPA FA!#TA E'!R!AN DAN I#"! PENDIDIAN !NI,ERITA +E"*ER 2013 1
*A* I PENDA$!#!AN
1-1 #atar .ela/an
Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat-sifat keturunan (hereditas) serta segala sluk beluknya selama ilmiah. Genetika disebut juga ilmu keturunan, ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pearisan sifat, bagaimana sifat keturunan ilmu itu diturunkan dari generasi kegenerasi serta variasi-variasi yang mungkin timbul didalamnya atau yang menyertainya. Pearisan sifat tersebut dapat terjadi melalui proses seksual. Genetika berusaha membaakan material pembaa informasi untuk diariskan (bahan genetik), bagaimana informasi tersebut di ekspresikan ekspresi geneti! dan bagaimana informasi tersebut dipindahkan dari individu satu ke individu lain. P"# adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu D$% dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlaanan dan mengapit dua target D$%. &esederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens D$% yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya. Dunia sekarang sedang mengalami perkembangan teknologi se!ara besar besaran. 'al ini dapat kita rasakan dalam berbagai bidang, salah satunya adalah bidang kedokteran. ebagai !ontoh dari perkembangan teknologi kedokteran adalah ditemukannya ilmu biologi molekuler. iologi molekuler merupakan salah satu !abang biologi yang merujuk kepada pengkajian mengenai kehidupan pada skala molekul. *ni termasuk penyelidikan tentang interaksi molekul dalam benda hidup dan kesannya, terutama tentang interaksi berbagai sistem dalam sel, termasuk interaksi D$%, #$%, dan sintesis protein, dan bagaimana interaksi tersebut diatur. iologi molekuler memberikan kontribusi yang amat sangat nyata dalam bidang kedokteran. Dahulu, untuk mengetahui penyakit yang diderita harus dengan menemukan organisme penyebab penyakit tersebut didalam tubuh. Dan jika tidak ditemukan pasien dinyatakan negatif dan tidak diberikan tindakan apapun. Padahal kenyataanya tidak semua penyakit organisme penyebabnya dapat
2
ditemukan dengan mudah. $amun dengan adanya biologi molekuler dokter dapat memeriksa penyebab sampai dengan pada D$% pasien. %sam nukleat merupakan suatu polinukleotida, yaitu polimer linier yang tersusun dari monomer-monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfodiester. +ungsi utama asam nukleat adalah sebagai tempat penyimpanan dan pemindahan informasi genetik. *nformasi ini diteruskan dari sel induk ke sel anak melalui proses replikasi. el memiliki dua jenis asam nukleat yaitu asam deoksiribonukleat
(deoyribonu!lei!
a!idD$%)
dan
asam
ribonukleat
(ribonu!lei! a!id#$%). Penggunaan metode P"# diperlukan empat komponen utama, yakni D$% !etakan, oligonukleotida primer, deosiribonukleotida trifosfat (d$P) yang terdiri dari d%P, d"P, dGP, dP, dan) en/im polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sintesis rantai D$%. Proses P"# terdiri dari tiga tahap, yakni denaturasi, penempelan (annealing), dan amplifikasi. 1-2 Rmsan masalah
0. %pa pengertian P"#1 2. agaimana tahapan P"# dapat berlangsung1 3. &apan P"# mulai berperan1 4. %G%*5%$% %plikasi eknik P"# dalam kehidupan sehari-hari1 1-3 Tan
0. 6ntuk memahami konsep kegunaan tentang P"# 2. 5enjadi referensi tambahan yang menunjang keberhasilan pembelajaran matakuliah genetika. 3. 6ntuk mengetahui komponen dan proses P"# 1-% "anaat
agi penulis dan pemba!a dapat memperoleh pengetahuan tentang prose polymerase !hain rea!tion serta manfaat P"# bagi manusia.
3
*A* II PE"*A$AAN
2-1 Deinisi PCR ( Polymerase Chain Reaction )
Pada tahun 789 &ary 5ullis menemukan teknik penggandaan urutan basa nukleotida se!ara in vitro, sehingga tidak hanya sekedar digunakan untuk membuat fragmen pela!ak. +ragmen pela!ak yang diperlukan dalam seleksi rekombinan merupakan molekul D$% untai ganda yang urutan basanya harus komplementer dengan sebagian urutan basa fragmen (gen) yang dila!ak. Dengan demikian, maka P"# adalah teknik yang digunakan untuk memperbanyak D$% se!ara in vitro dengan !ara menginkubasinya bersama primer spesifik, polimerase D$% tahan panas dan nukleotida. eknik atau reaksi P"# akan lebih !epat dan selektif jika sumber D$% hanya sedikit atau tidak murni, namun jika D$% tersedia dalam jumlah besar maka pengklonaan D$% didalam sel merupakan metode yang paling baik untuk mempersiapkan gen tertentu. Dalam teknik P"# segmen sasaran spesifik apa pun didalam satu atau banyak molekul D$% dapat dengan !epet di perbanyak atau disalin berkali-kali dalam tabung reaksi. ehingga dengan otomatis P"# dapat membuat milyaran salinan segmen sasaran D$% dalam beberapa jam. edangkan jika dibandingkan dengan teknik mempertemukan klona dengan gen yang dikehendaki dan membiarkan gen itu bereplikasi didalam sel inang, maka akan membutuhkan aktu yang jauh lebih lama. ;ika di ibaratkan !ara kerja P"# adalah memfotokopi satu halaman saja, bukan memeriksa semua buku dalam perpustakaan. Pengklonaan gen adalah proses yang menghasilkan banyak salinan gen yang dikehendaki. alinan-salinan ini dapat digunakan dalam sekuensing gen tersebut, dalam menghasilkan protein yang dikodekan oleh gen tersebut.
2-2 om4onen PCR ( Polymerase Chain Reaction)
Penggandaan
urutan
basa
nukleotida
berlangsung
melalui
reaksi
polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang se!ara berantai selama beberapa putaran (siklus). iap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen
4
sintesis D$% seperti untai D$% yang akan digunakan sebagai ceta/an (tem4lat) , molekul oligonukleotida untai tunggal dengan ujung 2<-=' bebas yang berfungsi sebagai 4re/rsor (4rimer) , sumber basa nukleotida berupa empat ma!am 5NTP (d%P, dGP, d"P, dP), dan en6im DNA 4olimerase. D$% templat adalah D$% untai ganda yang membaa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. 6rutan basa ini disebut juga rtan taret (target sequence) . Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan
akumulasi hasil polimerisasi molekul primer. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 2> basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari d$P yang dikatalisasi oleh en/im D$% polimerase. $amun, pada P"# en/im D$% polimerase yang digunakan harus termosta.il karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda D
%$yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 84?"). alah satu en/im D$% polimerase yang umum digunakan adalah Taq D$% polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.
2-3 Te/ni/ 5an Taha4an Tera5inya PCR ( Polymerase Chain Reaction)
iap putaran reaksi P"# terdiri atas tiga tahap, yaitu 5enatrasi tem4lat , 4enem4elan 4rimer, dan 4olimerisasi 4rimer, yang masing-masing berlangsung
pada suhu lebih kurang 84?", 4>?", dan >?". Pada tahap denaturasi, pasangan untai D$% templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. ;adi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal D$% templat. iasanya, kedua primer tersebut dinamakan 4rimer ma (forward primer) dan 4rimer mn5r (reverse primer) . etelah menempel pada
untai D$% templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 4< D$% templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5 ke ! atau berarti dari ujung ! ke 5 untai templatn"a) . Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai D$% jika D$% templat aalnya berupa sepasang untai D$%.
5
Pasangan-pasangan untai D$% yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. egitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen D$% pendek sebanyak 0n @ 0n. +ragmen D$% pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. +ragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi). isa kita bayangkan seandainya P"# dilakukan dalam 0> putaran saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 0 0> @ 0.0> A 7.>394B @ 3> A 7.>3942B C ;umlah ini masih dengan asumsi baha D$% templat aalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin D$% templat aal hanya berupa satu untai ganda. ;ika D$% templat aal terdiri atas 0> untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 0> menjadi 0>.8>.0>, suatu jumlah yang sangat !ukup bila akan digunakan sebagai fragmen pela!ak. ahapan P"# yang paling menentukan adalah penempelan primer. epasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. 6ntuk itu urutan basanya harus komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi !ukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. =leh karena itu, diperlukan !ara tertentu untuk meran!ang urutan basa kedua primer yang akan digunakan. Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan dengan urutan basa sekuens target. 6rutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah spesiesstrain organisme lainnya yang telah diketahuidipublikasikan. ebagai !ontoh, untuk meran!ang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen lipase pada isolat #acillus termofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas $luorescens, P% mendocina , dan sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.
6
6rutan-urutan basa fragmen tertentu dari
berbagai
tersebut
strain
kemudian
dijajarkan dan di!ari satu daerah atau lebih yang
memperlihatkan
homologi tinggi antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan 5aerah
lestari
(conserved
area) .
ebagianseluruh urutan
basa
pada
daerah
lestari
inilah
yang
akan
menjadi
urutan basa primer. ebenarnya, daerah
lestari
juga
dapat
ditentukan
melalui
penjajaran
urutan
asam
amino
pada tingkat protein. 6rutan asam amino ini kemudian
diturunkan
ke urutan basa D$%. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh
lebih
dari satu urutan basa
7
D
%$karena
setiap
asam
amino
dapat
disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan urutan basa sema!am ini dinamakan 4rimer degenerate. elain itu, primer yang disusun melalui penjajaran urutan basa D$% pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa pada daerah lestari di tingkat D$% pun tidak selamanya memperlihatkan homologi sempurna (7>>). 6rutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya 4rimer75imer akibat homologi sendiri (sel$&homolog") atau homologi silang
(cross&homolog"). elain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah tem4el (mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. %nalisis
juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (T m) masing-masing primer dan kandungan G"-nya. epasang primer yang baik harus mempunyai T m yang relatif sama dengan kandungan G" yang !ukup tinggi.
2-% A4li/asi te/ni/ PCR
&ary 5ullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan P"# pada tahun 7893. aat ini P"# sudah digunakan se!ara luas untuk berbagai ma!am kebutuhan, diantaranya: a-
Isolasi 'en
D$% makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, D$% manusia saja panjangnya sekitar 2 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. ebagaimana kita tahu baha fungsi utama D$% adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, D$% ditranskrip menghasilkan #$%, #$% kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang D$% genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut Ejunk D$%<, D$% Esampah< yang fungsinya belum diketahui dengan baik. &embali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. ebagai !ontoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pankreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena
8
insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. erkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari D$% genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini F. !oli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga. 'asilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih !epat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang !ara konvensional yang harus Emengorbankan< sapi atau babi. 6ntuk mengisolasi gen, diperlukan D$% pen!ari atau dikenal dengan nama Eprobe< yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik P"# menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
.-
DNA e8encin
6rutan basa suatu D$% dapat ditentukan dengan teknik D$% euen!ing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode anger (!hain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoy terminator, dimana proses aalnya adalah reaksi P"# dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (P"# biasa menggunakan 0 primer) dan adanya tambahan dideoynu!leotide yang dilabel fluores!ent. &arena arna fluores!ent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu D$% yang tidak diketahui bisa ditentukan.
c-
Forensi/
*dentifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban ke!elakaanben!ana kadang sulit dilakukan. ;ika identifikasi se!ara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian D$% adalah pilihan yang tepat. D$% dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa P"# untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu D$% yang disebut fingerprints alias D$% sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. 'asilnya dibandingkan dengan D$% sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. ;ika memiliki ke!o!okan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. &onon banyak
9
kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua Esesungguhnya< dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
5-
Dianosa Penya/it
Penyakit *nfluen/a % ('7$7) yang sebelumnya disebut flu babi sedang meabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang !epat dan akurat. P"# merupakan teknik yang sering digunakan. eknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena P"# mengamplifikasi daerah tertentu D$% yang merupakan !iri khas virus *nfluen/a % ('7$7) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.
10
*A* III EI"P!#AN
#eaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai P"# (kependekan dari istilah bahasa *nggris pol"merase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) D$% se!ara en/imatik tanpa menggunakan organisme. e!ara prinsip, P"# merupakan proses yang diulangulang antara dua puluh sampai tiga puluh kali siklus. etiap siklus terdiri atas tiga tahap yaitu ahap peleburan (melting ) atau denaturasi, ahap penempelan atau annealing dan ahap pemanjangan atau elongasi. Hepas tahap ketika, siklus diulang kembali mulai tahap satu. %kibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. %khirnya terdapat berkas D$% yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. ;umlah D$% yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi se!ara eksponensial.
11
DAFTAR P!TAA
http:apikdeefppundip0>77.ordpress.!om0>70>B08makalah-genetika-p!r polimerase-!hain-rea!tion
http:pustaka.unpad.a!.idp-!ontentuploads0>77>8pustakaIunpadIp!r.pdf
http:apikdeefppundip0>77.ordpress.!om0>70>B08makalah-genetika-p!r polimerase-!hain-rea!tion
12
