LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORY METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
PEMBIMBING: Prof. DR. Dwi Suryanto, M.Sc
Oleh: Juwita Sahputri (157027003)
Magister Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara 2016
PCR ( Polymerase Chain Reaction)
1. Tujuan Praktikum
Mengamplifikasi atau memperbanyak fragmen DNA hasil isolasi 2. Landasan Teori
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (template) yang mengandung DNA-target untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer. Bahan-bahan yang dibutuhkan pada proses reaksi PCR adalah sebagai berikut:
1. DNA template DNA template berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. 2. Primer Primer adalah suatu polimer asam nukleat pendek (oligonukleotida) yang mempunyai urutan nukelotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA template, dNTPs, Buffer, dan enzim DNA polimerase. Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus
menyediakan gugus hidroksi (OH) pada ujung 3 ’ yang diperlukan untuk proses ekstensi DNA. 3. DNA Polimerase DNA Polimerase (Taq polimerase) merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan berfungsi sebagai katalis untuk reaksi polimerasi DNA dan ekstensi DNA. 4. Bufer Buffer berfungsi untuk menjaga keseimbangan pH medium. Umumnya mengandung senyawa MgCl 2 yang bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase serta meningkatkan interaksi primer dengan template yang membentuk kompleks larut dengan dNTP. 5. dNTPs dNTPs (deoksinucleotide trifosfat) merupakan campuran dari dATP ( deoksiadenosin trifosfat ), dTTP (deoksitimidin trifosfat ), dCTP (deoksisistidin trifosfat ), dan dGTP ( deoksiguanosin trifosfat ). dNTPs ini bertindak sebagai
building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik di mana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial Proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap berurutan yaitu: a. Denaturasi Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasiyang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen antara basa-basa yang komplemen. Denaturasi dilakukan pada suhu 90 0C-950C. b. Annealing (penempelan) pasangan primer pada untai DNA target Pada tahap ini primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer, pada proses anneling, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Prfoses ini biasanya
dilakukan pada suhu 50 0C-600C. selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali. c. Extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA Tahap ini dilakukan pada suhu 72 0C. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan template oleh DNA polimerase. Jika siklus ini dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial. Tahap elongasi akhir selama 5 - 15 menit (tergantung panjang cetakan DNA) setelah siklus terakhir dapat digunakan untuk menjamin DNA rantai tunggal sisa diperpanjang seluruhnya.
Gambar 1 amplifikasi eksponensial gen oleh PCR
Gambar tahap-tahap PCR
3. Praktikum PCR Waktu dan tempat
: Praktikum Isolasi DNA dilakukan tanggal 11 November 2016
pukul 10.00-13.30 WIB di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan.
a. Alat dan bahan:
Alat:
Mesin thermal cycler
tabung PCR 0.2 ml
sarung tangan
mikopipet eppendorf dan tips.
Bahan:
PCR Master Miix Kit Promega
DNA template
Primer Reverse
Primer Forward
Nuclease free water
Gambar 1 Mesin Thermal Cycler
b. Cara Kerja: 1. Siapkan larutan Mix Solution untuk 5 sampel + 1 kontrol yaitu:
Tabel 1. Campuran Larutan PCR ( cocktail )
Bahan
1 sampel (µL)
5 sampel (µL)
Master mix 2x
12,5
12,5
Primer F (Forward)
0.25
1.75
Primer R (Reverse)
0.25
1.75
N. F. Water
8.5
8.5
Template DNA
2 (ditambahkan kemudian)
2. Siapkan 5 tabung PCR dipipetkan sebanyak 12.5 µl Mix Solution dan masukkan
ke masing-masing tabung PCR. 3. Tambahkan 2 µl DNA sampel, lalu vortex 4. Sertakan kontrol negatif dalam setiap menjalankan PCR (kontrol negatif = tabung
PCR hanya berisi Mix Solution, tanpa penambahan larutan DNA sampel). 5. Kemudian disentrifuse selama 3 menit dengan kecepatan 13.000 rpm 6. Kemudian masukkan ke mesin thermo cycler dengan ketentuan:
Tabel 3. PCR Protokol untuk Amplifikasi Gen Fibrinogen
Langkah
Suhu (ºC)
Waktu
Siklus (kali)
Hot start
95
7 menit
1
Denaturasi
95
15 detik
Annealing
60
45 detik
Extensi
72
30 detik
Extensi
72
7 menit
1
Soaking
4
7 menit
1
35
c. Hasil dan Pembahasan
Dari hasil PCR yang melalui 3 tahapan penting yaitu denaturasi, annealing, dan extension, serta bantuan enzim Taq Polimerase, didapatkan perbanyakan segmen DNA yang spesifik dengan jumlah perbanyakan 2n, dimana n adalah jumlah siklus yang dilakukan. Jadi setelah dilakukan PCR dengan 38 siklus didapatkan perbanyakan segmen DNA dengan jumlah 2n.Diperoleh sampel PCR yang berupa cairan bening.Hasil sampel PCR tersebut dapat disimpan pada suhu 4 OC untuk digunakan pada praktikum selanjutnya.Hasil sampel PCR dideteksi dengan elektroforesis. Pada praktikum ini akan dideteksi DNA Fibrinogen pada darah dengan panjang DNA 660 bp.
ELEKTROFORESIS
1. Tujuan Praktikum 1. Mengetahui DNA yang terbentuk dari hasil isolasi DNA dan hasil PCR. 2. Memahami prinsip dasar PCR dan Elektroforesis Agarose. 3. Menggunakan alat Elektroforesis dengan benar untuk membaca nilai base
pair fragmentDNA. 2. Landasan Teori Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang dilakukan untuk menganalisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF, dll). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Molekul protein bermigrasi pada medium padat/ gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga dibawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein. Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung didalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif akan bergerak menuju kutub positif, sedangkan molekul-molekul bermuatan positif akan bergerak menuju kutub negatif. Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu.
Elektroforesis
gel
memisahkan
makromolekul
berdasarkan
laju
perpindahannya melewati suatu gel dibahwah pengaruh medan listrik. Elektroforesis memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.Molekul DNA yang lebih kecil, akan lebih cepat keluar dari pada molekul DNA yang besar. Sehingga akhir dari proses elektroforesis ini akan didapatkan molekul DNA yang berurutan dari yang paling kecil sampai yang terbesar. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif. Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya . Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan dibawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. Ethidium Bromida merupakan bahan mutagenik dan karsinogenik.
3. Praktikum Elektroforesis Waktu dan Tempat : Praktikum Isolasi DNA dilakukan tanggal 11 November 2016
pukul 10.00-13.30 WIB di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan.
a. Alat dan Bahan :
Alat: -
Satu set alat elektroforesis chamber kecil
-
Lampu UV
-
Erlemeyer
-
Tabung ukur
Bahan: -
Larutan TAE (buffer TAE)
-
Loading dye
-
Ethidium Bromida
-
Agarosa bubuk 2 %
-
Larutan hasil isolasi DNA dan hasil PCR
b. Cara kerja:
Pembuatan gel agarose
1. Membuat stok TAE 1x dari TAE 50x 2. Untuk tiap 1000 ml stok TAE 1x V1x N1 = V2x N2 V1 50x = (1/50)X1000ml V150x = 20 ml DDW( double distilled water) yang diperlukan adalah V DDW = 1000 -20 ml = 980 ml Siapkan 1x TAE (disiapkan dari 50X stok) 3. Membuat gel agarosa 2% dengan cara menyiapkan erlenmeyer, menimbang 0,7 gram agarosa dan memasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian menambahkan 35 ml TAE Buffer ( menggunakan chamber kecil) 4. Panaskan dalam microvawe sampai mendidih da n larutan jernih o
5. Dinginkan agarose kira kira 60 C dan tambahkan 5 uL etidium bromide (10ml/mg) dan camour hingga merata 6. Tuang larutan dalam tray dan pasang well forming combs tunggu kurang lebih 30 menit aau sampai gel mengeras. 7. Lepas well foeming combs secara perlahan lahan dan gel siap digunakan untuk elektroforesis.
Proses Elektroforesis
1. Pasang tray ke dalam chamber elektroforesis, kemudian tuang larutan 1 x buffer TAE ke dalam chamber tersebut hingga 1 mm diatas permukaan gel tersebut 2. Masukkan loading dye (1uL) + DNA (5 uL) ke dalam sumur 3. Tutup tray dan hubungkan alat elektroforesis dengan power supply, 100 mV selama 1 jam. 4. Amati pita-pita DNA yang terbentuk dengan menggunakan UV, kemudian foto dengan kamera polaroid
c. Hasil Pengamatan dan Pembahasan
Gambar Tray berisi agarose
Gambar proses elektroforeksis berlangsung
Keterangan
: 1
Marker
2
Kontrol negative
3-7 Produk PCR untuk gen β fibrinogen
Pada sumur 1 terlihat adanya marker dimana band yang terbentuk dari hasil elektroforesis adalah marker yang panjangnya 100 bp hingga 1000 bp
Pada sumur 2 yaitu kontrol negative terlihat tidak terbentuk band dari DNA, ini menunjukkan kontrol negative tidak terkontaminasi (pada kontrol negative ini t idak terdapat DNA didalamnya)
Pada sumur 3 s/d 7 merupakan produk PCR yang berada diantara 600-700 bp, ini menujukkna gen yang didekteksi benar adanya gen β fibrinogen.
Pada sumur 3 dan 5 band yang terlihat sangat halus dan kabur, sumur 4 dan 6 band terlihat sangat jelas sedangkan pada sumur 7 terlihat pita yang yang tidak lurus (ada bercak).
Kesimpulan
Terdapat beberapa kemungkinan penyebab DNA tidak terdeteksi setelah dilakukan proses PCR. Kemungkinan penyebab antara lain berkaitan dengan temperature dan lamanya siklus PCR serta kerusakan/kontaminasi pada komponen PCR. Untuk itu diperlukan ketelitian dalam mengerjakan PCR, mulai dari menyiapkan sample DNA hingga selesai.
