Laporan Praktikum Genetika
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Widya Setyaningtyas*, Haniyya, I. Sobari, K.S. Juarna, N. Restiana, Nuruliawati, Annisa, M. Khaerulloh
Universitas Indonesia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Departemen Biologi April 2012
Abstrak Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang digunakan untuk memperbanyak atau amplifikasi sekuen DNA yang spesifik secara in vitro sehingga menghasilkan jutaan copy DNA. Teknik PCR dilakukan setelah melakukan isolasi DNA. Siklus PCR terdiri atas 3 tahap yaitu denaturasi (pemisahan), annealing (pelekatan) dan elongasi (pemanjangan). Tahapan-tahapan pada siklus PCR dipengaruhi oleh suhu dan waktu yang berbeda-beda. Keberhasilan pelekatan primer dan DNA template dipengaruhi oleh melting temperature (Tm). Komponen-komponen yang berperan penting dalam reaksi PCR yaitu DNA template, PCR buffer, kation divalen, nuclease free water, Deoxynucleoside Triphosphat (dNTP), enzim Taq DNA polymerase, primer. Setiap komponen memiliki fungsi dan kegunaan masingmasing. Teknik PCR digunakan untuk diagnosis penyakit genetik, studi forensik (DNA fingerprinting), terapi gen, proyek pemetaan genom serta berbagai aplikasi analisis genetik lainnya. Hasil praktikum didapatkan salinan sekuen DNA yang spesifik. Kata kunci : Polymerase Chain Reaction (PCR); DNA; DNA polymerase; melting temperature
tertentu secara in vitro dengan cara mensintesis molekul
1. Pendahuluan
DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu
teknik
molekular
yang
digunakan
untuk
menggandakan jumlah molekul DNA pada target
*) Kelompok 2A
target
tersebut
melalui
bantuan
enzim
dan
oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermal cycler (Russel 1996: 304). PCR pertama kali ditemukan
1
oleh Kary Mullis pada tahun 1985 (Butler 2005: 63). Prinsip
kerja
penggandaan
menentukan serta mengidentifikasi daerah spesifik dari
(amplifikasi) DNA target tertentu dibantu oleh enzim
DNA target yang akan diamplifikasi. (Butler 2005: 65).
DNA polymerase yang akan memperbanyak bagian
Primer yang berada sebelum DNA template disebut
spesifik yang diinisiasi oleh primer dengan cara
sebagai primer forward dan primer yang berada setelah
menghubungkan dNTP-dNTP dalam suatu reaksi termal
DNA template disebut sebagai primer reverse. Primer
(Wolfe 1993: 137).
berukuran paling pendek sebanyak 16 basa dan biasanya
Suatu
PCR
adalah
reaksi
PCR
proses
Primer bagian yang berfungsi untuk mengapit ,
dilakukan
dengan
berkisar antara 18 sampai dengan 24 basa. Konsentrasi
menambahkan komponen- komponen penting kemudian
primer yang dibutuhkan dalam proses PCR sekitar 1
diencerkan menggunakan nuclease free water (pelarut)
Primer merupakan pembatas fragmen DNA target yang
sampai didapatkan konsentrasi yang diinginkan dari
akan diamplifikasi dan berfungsi sebagai penyedia
setiap komponen tersebut (Butler 2005: 65). Komponen-
gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan
komponen penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR
pada proses eksistensi DNA. Kandungan G+C atau
adalah DNA template, larutan penyangga (PCR buffer),
persentase jumlah G dan C sebaiknya sama atau lebih
enzim DNA polymerase, Deoxynucleoside Triphosphat
besar dari kandungan G+C DNA target, karena primer
(dNTP),dan primer (Muladno 2010: 64). DNA template
dengan persentase G+C yang lebih rendah tidak akan
adalah cetakan DNA yang terdiri dari empat nukleotida.
mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif
DNA template berfungsi untuk memastikan bahwa
pada tempat yang dituju, sehingga akan menurunkan
reaksi PCR terjadi pada sekuen DNA spesifik yang
efisiensi proses PCR.
diinginkan. Larutan penyangga (PCR buffer) berguna
memiliki urutan nukleotida G atau C pada ujung 3’,
menjaga
PCR
karena jika pada ujung 3’ terdapat urutan nukleotida A
berlangsung. Enzim DNA polymerase yang paling
atau T, maka primer tersebut dapat menurunkan
banyak digunakan adalah Taq DNA polymerase. Taq
spesifitas primer itu sendiri. Primer yang baik juga harus
DNA polymerase berasal dari sel bakteri Thermus
memiliki melting Temperature (Tm) yang berkisar
aquaticus yang hidup di lingkungan dengan panas yang
antara 50-65ºC (Muladno 2010: 64-65).
ekstrim
keseimbangan
(Butler
2005:
PH
selama
Deoxynucleoside
Satu siklus PCR terdiri atas 3 tahap yaitu
Triphosphat (dNTP) merupakan material utama untuk
denaturasi (pemisahan), annealing (pelekatan), dan
membentuk basa komplementer pada hasil cetakan
elongasi (pemanjangan) (Stratchan & Read 1996: 129).
DNA. Deoxynucleoside Triphosphat (dNTP) terdiri atas
Denaturasi terjadi pada suhu 95oC selama waktu 30
dATP
detik.
(Deoxyadenosine
67-68).
reaksi
Primer yang baik juga harus
Triphosphat),
dCTP
Tahapan
denaturasi
adalah
tahapan
untuk
(Deoxycytosine Triphosphat), dGTP (Deoxyguanine
menghentikan reaksi enzimatik yang tejadi sehingga
Triphosphat), dan dTTP (Deoxythymine Triphosphat).
ikatan hidrogen terputus dan untai ganda DNA akan
Primer digunakan untuk mengidentifikasi DNA template
terbuka menjadi untai tunggal. Tahapan annealing
yang akan digandakan (Muladno 2010: 65).
terjadi pada saat suhu berkisar antara 50oC sampai dengan 60oC. Primer forward yang berkomplemen
2
dengan salah satu untai tunggal akan menempel pada
inhibitor pada ekstraksi DNA (Butler 2005: 81). Metode
posisi komplemennya dan juga primer reverse akan
PCR juga memerlukan biaya yang cukup mahal, rentan
menempel pada untai tunggal lainnya. Setelah kedua
terhadap kontaminasi sehingga harus dilakukan kontrol
primer tersebut menempel pada posisinya masing-
kualitas yang sangat ketat, dan tidak dapat mendeteksi
masing enzim Taq DNA polymerase mulai membantu
mutasi (Dale & Park 2004: 65).
mensintesis molekul DNA baru. Proses ini disebut
Aplikasi dari PCR antara lain adalah untuk studi
o
sebagai tahapan elongasi yang terjadi pada suhu 72 C.
forensik (DNA fingerprinting), terapi gen, diagnosa
Tahapan elongasi ini akan membuat sekuen DNA
penyakit genetik serta berbagai aplikasi analisis genetik
spesifik akan berlipat jumlahnya. Proses PCR biasanya
lainnya. DNA fingerprinting menggunakan prinsip tidak
berlangsung hingga 30 sampai dengan 40 siklus
ada individu yang memiliki sidik jari yang sama
(Stansfield dkk. 2006: 84).
sehingga sidik jari yang ditinggalkan di tempat kejadian
Keberhasilan pelekatan antara primer dan DNA
perkara (TKP) dapat menjadi bukti yang penting untuk
template ditentukan oleh Tm (melting temperature).
penyelidikan dan identifikasi pelaku kejahatan. Penyakit
Temperatur penempelan yang digunakan biasanya 5oC ±
gen dapat diobati dengan terapi gen. Penyakit genetik
dari nilai Tm. Semakin panjang ukuran primer maka
dihasilkan dari fenotip yang terkena mutasi pada sel
semakin tinggi temperaturnya. Rumus untuk menghitung
somatik. Secara teori ada 2 tipe terapi gen yaitu terapi
nilai Tm adalah
sel somatik dan terapi sel gamet (Russell 1994: 310).
G adalah jumlah basa guanin, C adalah junlah basa
2. Metodologi
sitosin, A adalah jumlah basa adenin, dan T adalah
Alat yang digunakan pada praktikum PCR antara
jumlah basa timin (Muladno 2010: 63).
lain micro tube, pipet mikro, tips, sarung tangan, dan
Kelebihan metode PCR dibandingkan ddengan
mesin thermal cycler. Bahan yang digunakan pada
teknik lain yaitu DNA template yang digunakan dapat
praktikum PCR adalah DNA template (disc) danreaction
berjumlah sedikit dan diambil dari sel yang sama
mix yang terdiri dari 14
kecilnya (Butler 2005: 80). Kelebihan yang dimiliki oleh
Robust Buffer A dengan Mg 4
teknik PCR adalah teknik tersebut dapat bekerja pada
20
sampel yang sudah tua, langka, dan memiliki urutan
, 10 mm dNTPs 0.4
primer forward FvCRF 0.3
reverse FvCRR 0.3
basa nukleotida yang sedikit (Lewis 2003: 186).
ddH2O steril, Kapa 2G
, 20
,
primer
, dan 2G Kapa Robust (5 U/
).
Cara kerja pada praktikum PCR yaitu pertama
Kelebihan lainnya adalah kecepatan metode PCR lebih
reaction mix yang terdiri atas komponen-komponen
cepat bila dibandingkan dengan Reaction fragment
penting dimasukkan ke dalam tube. Tahapan kerja
length polymorphism atau dengan Southern analisis.
pembuatan reaction mixture diawali dengan pemberian
Reaksi yang dihasilkan metode PCR juga lebih spesifik
ddH2O steril dengan menggunakan mikropipet ke dalam
dan akurat serta mudah dilakukan secara otomatis (Dale
tabung PCR dengan volume masing-masing bagian 14
& Park 2004: 65). Kekurangan metode PCR yaitu DNA
µl, sehingga diberikan 28 µl ke dalam tube tersebut. 5x
template tidak dapat diamplifikasi karena adanya
Kapa 2G Robust Buffer A with Mg ditambahkan ke
3
dalam tube tersebut dengan volume untuk masing-
Robust (5 U/
masing bagian sebanyak 4 µl, sehingga diberikan dengan
komponen telah dimasukkan ke dalam tube, thawing
volume 8 µl. Setelah itu, 10 mM dNTPs ditambahkan
tube dengan perlahan agar semua komponen larut
dengan volume
sempurna. Keempat, reaction mixture siap diletakkan
masing-masing 0.4 µl, sehingga
diberikan dengan volume 0.8 µl. Setelah ditambahkan
) ke dalam tube. Ketiga, setelah semua
pada mesin thermal cycler (Spormann 2009: 1).
dNTPs, diberikan 20 µM primer FvCRF (forward) dan
Enzim DNA polymerase yang digunakan pada
20 µM primer FvCRR (reverse) untuk pembuatan satu
saat proses perbanyakan atau ampifikasi DNA adalah
takaran reaction mixture, sehingga diberikan 40 µM
Taq DNA polymerase. Taq DNA polymerase berasal
primer FvCRF dan 40 µM primer FvCRR ke dalam
dari sel bakteri Thermus aquaticus yang hidup di sumber
tabung PCR tersebut. 2G Kapa Robust dengan takaran
mata air panas (Butler 2005: 67). Bakteri Thermus
0.5 U untuk satu reaksi, sehingga diberikan ke dalam
aquaticus mempunyai enzim termostabil sehingga dapat
tabung tersebut sebanyak 1 U. Campuran tersebut dibagi
hidup di lingkungan yang sangat panas. Enzim
menjadi dua bagian yang sama ke dalam dua tube PCR
termostabil digunakan dalam reaksi PCR karena enzim
yang berbeda. Kedua, DNA template dimasukkan ke
tersebut tahan terhadap panas sehingga enzim tidak akan
dalam tube yang telah berisi reaction mix. Ketiga,
terdenaturasi (Brown 1993: 412).
tahapan pembuatan program untuk siklus PCR dimulai dari
penekanan
tombol
[CREATE]
jika
Praktikum reaksi PCR memiliki beberapa tahapan
ingin
yang harus diperhatikan kondisinya. Kondisi tersebut
memprogram ulang suhu dan waktu yang diinginkan
mempengaruhi keefisienan kerja reaksi dan hasil reaksi.
dalam siklus PCR. Keempat, program yang telah selesai
Tahapan denaturasi yang harus diperhatikan adalah
dibuat, disimpan dan tube dimasukkan ke dalam mesin
suhu, tahap denaturasi harus terjadi pada suhu 95oC
thermal cycle, setelah itu tekan tombol [RUN] untuk
selama 30 detik atau 97oC selama 15 detik. Denaturasi
menjalankan program. Mesin thermal cycler yang
yang
digunakan dalam praktikum PCR adalah Perkin Elmer
mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda
9600.
lagi) secara cepat sehingga mengakibatkan gagalnya
tidak
lengkap
akan
mengakibatkan
DNA
proses PCR. Waktu dalam tahapan denaturasi juga harus 3. Hasil dan Pembahasan
diperhatikan jangan sampai terlalu lama karena akan mengurangi aktivitas enzim Taq DNA polymerase.
Tahapan kerja pembuatan reaction mixture PCR yaitu pertama ddH2O steril sebanyak 14
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer
dimasukkan
yang baik adalah primer tersebut sebaiknya berukuran
ke dalam tube, fungsinya adalah sebagai pelarut
18-25 basa, dan mengandung 50-60% guanin dan
sehingga komponen lain yang dimasukkan ke dalam
sitosin. Sekuen DNA kedua primer tidak boleh saling
tube dapat langsung larut. Kedua, tambahkan komponen
berkomplemen karena akan menyebabkan terjadinya
lain seperti Kapa 2G Robust Buffer A dengan Mg 4
,
penempelan antar primer yang kemudian membentuk
primer forward FvCRF 0.3
primer-dimer. Sekuen DNA di dalam masing-masing
10 mm dNTPs 0.4 , 20
, 20
primer reverse FvCRR 0.3
primer sebaiknya juga tidak saling berkomplemen
, dan 2G Kapa
4
karena akan mengakibatkan terbentuknya struktur
masing untai dilipatgandakan menjadi 16 molekul DNA
sekunder pada primer tersebut sehingga mengurangi
untai ganda yang baru. Siklus kelima berakhir, 16
efisiensi PCR. Tahap elongasi harus terjadi pada suhu
molekul DNA untai ganda hasil amplifikasi pada siklus
o
72 C. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim Taq
keempat menjadi DNA template dan kemudian masing-
DNA polymerase diperkirakan antara 35 sampai dengan
masing untai dilipatgandakan menjadi 32 molekul DNA
100 nukleotida per detik (Muladno 2010: 63-64).
untai ganda yang baru. amplifikasi rantai DNA hingga
Optimasi PCR perlu dilakukan agar reaksi PCR
lima siklus menghasilkan 32 molekul DNA untai ganda
dapat berlangsung secara efisien dan mendapatkan hasil
(Muladno 2010: 62).
yang konsisten. Suhu dan waktu pada tahap denaturasi dipengaruhi oleh enzim Taq DNA polymerasedan
4. Kesimpulan
bersifat permanen. Suhu penempelan antara primer dan DNA template serta waktu yang diperlukan pada tahap
Polymerase Chain Reaction (PCR ) adalah teknik
annealing dipengaruhi oleh panjang pendek primer.
yang digunakan untuk memperbanyak sekuen DNA
Kecepatan penyusunan nukeleotida pada tahap elongasi
spesifik secara in vitro sehingga menghasilkan jutaan
bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam, dan
copy DNA. Reaksi PCR membutuhkan komponen-
molekul DNA target, sedangkan suhunya bersifat
komponen penting yaitu ddH2O steril sebagai pelarut,
permanen (Fraga dkk. 2008: 5--6).
Kapa 2G Robust Buffer untuk menjaga keseimbanagn
Amplifikasi rantai DNA dimulai dari tahap
PH
serta mengandung kation Mg yang berfungsi
denaturasi, saat tahapan denaturasi untai ganda DNA
sebagai kofaktor enzim yang mempercepat reaksi.
berpisah menjadi untai tunggal kemudian primer
Enzim
menempel pada DNA template pada tahap annealing.
menghasilkan pemanjangan cetakan DNA dengan
Tahapan elongasi yaitu setiap untai menghasilkan untai
menghubungkan dNTP-dNTP. Amplifikasi pada setiap
yang panjang sehingga siklus pertama selesai. Proses
siklus menghasilkan jumlah molekul DNA yang sesuai
dari denaturasi, annealing, dan elongasi disebut sebagai
rumus
Taq
DNA
polymerase
berfungsi
untuk
, dengan n adalah jumlah siklus.
satu siklus. Siklus pertama tersebut menghasilkan 2 molekul DNA untai ganda. Saat siklus kedua berakhir, 2
Daftar Pustaka
molekul DNA untai ganda hasil amplifikasi pada siklus pertama menjadi DNA templatedan kemudian masingmasinguntai dilipatgandakan menjadi 4 molekul DNA
Brown, T.A. 1993. Genetics: a molecular approach, 2nd
untai ganda yang baru. Siklus ketiga berakhir maka akan
ed. Fong & Sons Printers Pte Ltd., Singapore: xiii
terbentuk
+ 467 hlm.
4 molekul DNA untai ganda, kemudian
masing-masing untai dilipatgandakan menjadi 8 molekul
Butler, J.M. 2005.Forensic DNA Typing, 2nd ed. Elsevier
DNA untai ganda yang baru. Siklus keempat berakhir, 8
Academic Press, New York: xvii + 660 hlm.
molekul DNA untai ganda hasil amplifikasi pada siklus ketiga menjadi DNA template dan kemudian masing-
5
Dale, J.W. & S.F. Park. 2004. Molecular genetics of bacteria. John Wiley & Sons Ltd., West Sussex: xi + 379 hlm. Fraga, D., T. Meulia& S. Fenster. 2008. Real-Time PCR. Journal of Current Protocols Essential Laboratory Techniques 10(3): 1-34. Lewis, Ricki. 2003. Human genetics concepts and applications.
5th
ed.
The
McGraw-Hill
Companies, New York: xviii + 454 hlm. Muladno. 2010. TeknologiRekayasaGenetika. Ed. Ke2.IPB Press, Bogor: ix + 130 hlm. Russel, P.J. 1996. Genetics. 4th ed. HarperCollins College Publishers, New York: 784 hlm. Russell, P. J. 1994. Fundamental of Genetics. Harper Collins College Publisher, USA: xvi + 528 hlm. Spormann, A.M. 2009. Polymerase Chain Reaction (PCR): 1 hlm. http://www.stanford.edu/group/spormannlab/cgibin/amslab/content/polymerase-chain-reaction-pcr 25 April 2012, pk. 06.52am. Stansfield, W., R.J. Cano & J.S. 2006. Colome. Schaum’s easy outlines: molecular and cells biology. terj. dari Strachan, T. & Read, A.P. 1996. Human Molecular Genetics.John Willey& Sons, Inc., New York: x + 596hlm. Wolfe,
S.L.
1993.
biology.Wadsworth
Molecular Publishing
and
cellular Company,
Belmont: xviii + 1145 hlm.
6
Lampiran
1. Hitunglah nilai Tm dari primer berikut menggunakan metode Wallace :
a. Primer Forward : 5’-GGAATTCGACATTAAGATGA-’3
b. Primer Reverse : 3’- GTGGTAGTGGTGGTGGT -’5
Primer Forward Jumlah G = 5 Jumlah C= 2 Jumlah A= 8 Jumlah T= 5 Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) Tm = 4( 5+2) + 2 (8+5) Tm = 28 + 26 Tm = 54 oC
Primer Reverse Jumlah G = 10 Jumlah C= 0 Jumlah A= 1 Jumlah T= 6 Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) Tm = 4 (10+0) + 2( 1+ 6) Tm = 40 + 14 Tm = 54 oC
7
8
9
