17
i
5
MAKALAH MIKROTEKNIK
"CLEARING (PENJERNIHAN)"
D
I
S
U
S
U
N
OLEH :
NAMA : FADH AKBAR PRAWIRANEGARA
NPM : 7111051028
PRODI : PENDIDIKAN BIOLOGI
SEMESTER : VIII (Delapan)
FAKULTAS KEGURUAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS ISLAM SUMATERA UTARA
MEDAN/2015
KATA PENGANTAR
Assalamualaikum Warahmatullahi Wabarakatuh
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan kita berbagai macam nikmat, sehingga aktifitas hidup yang kita jalani ini akan selalu membawa keberkahan, tersenyum, berpapaasan dengan Tuhan.
Ucapan terima kasih, tidak lupa saya sampaikan kepada pihak-pihak yang telah ikut serta membantu dalam pembuatan makalah ini. Serta tidak lupa juga untuk para sahabat dan rekan – rekan yang kiranya sudah memberikan dukungan dan bantuannya dalam pembuatan makalah ini.
Saya menyadari sekali, didalam penyusunan makalah ini masih jauh dari kesempurnaan serta banyak kekurangan-kekurangnya, baik dari segi tata bahasa maupun dalam hal pengkonsolidasian kepada dosen Mata Kuliah Mikroteknik yaitu Bapak Ir. H. M. Iskandar Pinem, M. Agr serta sahabat – sahabat sekalian, untuk itu besar harapan kami jika ada kritik dan saran yang membangun untuk lebih menyempurnakan makalah saya dilain waktu.
Dengan harapan, mudah - mudahan apa yang saya susun ini penuh manfaat, baik untuk pribadi, sahabat - sahabat, serta orang lain yang ingin mengambil atau menyempurnakan lagi atau mengambil hikmah dari judul ini (Clearing/Penjernihan) sebagai tambahan dalam menambah referensi yang telah ada.
Medan, 5 April 2015
Penyusun
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR i
DAFTAR ISI ii
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang 1
B. Tujuan 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA DAN PEMBAHASAN
A. Pengertian Mikroteknik 5
B. Jenis Bahan Sediaan dan Cara Pengambilan Spesimen 7
C. Metode Mikroteknik 11
D. Metode Parafin 13
E. Clearing (Penjernihan) 21
BAB III KESIMPULAN 25
DAFTAR PUSTAKA 26
iiii
ii
ii
BAB I
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu tumbuhanataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini ialahirisan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin.Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mkron, tapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifatseri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini.Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakanmetode ini. Sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada jaringan akan larutdengan menggunakan metode ini (Budiono : 1992).
Menurut Gunarso (1989) Mikroteknik atau teknik histologi merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Ruang lingkup yang mencakup materi mikroteknik dapat diperoleh dari sejumlah definisi dan peristilahan yang bisa dipakai, hanya saja sebaiknya kita mencamkan dalam pikiran kita bahwa suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian atau seluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain dilekapkan dengan kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun plastik yang tembus pandang yang direkatkan diatas spesimen tersebut Sedangkan menurut Amar (2008) Mikroteknik adalah ilmu yang akan mempelajari metode/ prosedur pembuatan preparat mikroskopik.
Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis, tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh mengenai Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih menekankan pemahaman pada wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan sediaan Mikroskopis (Zaifbio, 2010).
Sifat–sifat darisediaan ada yang sementara, semi permanen, dan permanen. Sumber sediaanadalah semua organisme atau yang pernah hidup baik itu tumbuhan, hewan,maupun manusia dan hasil pertumbuhannya (bagian atau keseluruhan tubuhorganisme). Garis besar pembuatan sediaan adalah pengambilan dan persiapanmaterial, fiksasi, pencucian, pewarnaan, dehidrasi, penjernihan, penempelan padagelas objek, dan pemberian nama. Beberapa metode dalam pembuatan sediaanantara lain: sediaan utuh (Whole Mount), sediaan apus (Smear), sediaan remas (Squash), sediaan gosok, Maserasi, dan sediaan sayatan tanpa embedding maupundengan embedding (Parafin, seloidin, maupun resin) (Kusuma, 2004).
Untuk klasifikasi praktis, bahan yang berasal dari hewan atau tumbuh-tumbuhan dapat dibedakan sebagai bahan yang lunak dan keras, normal atau yang bersifat patologis. Suau spesimen mungkin saja berisi campuran jaringan lunak dan keras, sedang bagian darinpadanya dapat normal dan bagian lain justru patologis sifatnya seperti halnya tumor pada tulang. Pada umumnya suatu jaringan lunak dapat diproses untuk pembuatan sayatan tanpa perlakuan khusus guna mengeluarkan atau melunakkan bagian-bagian yang keras. Dari sekian banyak jaringan hewan, maka kelanjar, tulang rawan yang tidak berkalsium, kulit, otot, saraf dan saluran darah adalah contoh-contoh jaringan lunak. Sedangkan tulang gigi, tulang rawan berkalsium, kitin dan berbagai struktur pada kulit seperti sisik, tangkai bulu dan lempengan kapur termasuk jaringan keras. Jaringan tumbuhan berbeda dengan jaringan hewa dalam satu hal penting, yaitu bahwa setiap sel tumbuhan terbungkus dalam membran yang cukup tangguh yang terutama terdiri dari selulosa. Membran tersebut berasal dari sel, sedang membran sitoplasma yag asli, yang sesuai dengan membran luar pada sel hewan, berada sedikit di sebelah dalamnya (Gunarso, 1989).
Dalam proses pembuatan sediaan perlu dilakukan proses penjernihan agar sediaan lebih mudah dan lenih jelas diamati dibawah mikroskop. Clearing merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari penjernihan ini adalah menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman dalam paraffin. Medium penjernih ini akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya.
Tujuan
Untuk mengetahui pengertian Mikroteknik.
Untuk mengetahui cara-cara membuat preparat atau sediaan.
Untuk mengetahui apa itu clearing/penjernihan.
Untuk mengetahui prosedur dalam melakukan penjernihan pada jaringan.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA DAN PEMBAHASAN
PENGERTIAN MIKROTEKNIK
Mikroteknik atau teknik histologi merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Ruang lingkup yang mencakup materi mikroteknik dapat diperoleh dari sejumlah definisi dan peristilahan yang bisa dipakai, hanya saja sebaiknya kita mencamkan dalam pikiran kita bahwa suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian atau seluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain dilekapkan dengan kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun plastik yang tembus pandang yang direkatkan diatas spesimen tersebut (Gunarso, 1989). Sedangkan menurut Amar (2008) Mikroteknik adalah ilmu yang akan mempelajari metode/ prosedur pembuatan preparat mikroskopik.
Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis, tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh mengenai Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih menekankan pemahaman pada wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan sediaan Mikroskopis (Zaifbio, 2010)
Organ adalah susunan dari bagian organisme, yang tujuannya melakukan fungsi tertentu ataupun kesatuan yang erat kaitannya. Dengan demikian pembuluh darah adalah organ yang fungsinya membawa atau mengalirkan darah. Hati adalah organ yang mempunyai banyak fungsi, akan tetapi sebagai kesatuan fungsi maka hati ini erat kaitannya dengan pencernaan dan asimilasi makanan (Gunarso, 1989).
Jaringan adalah kumpulan sel yang mempunyai fungsi tertentu yang khas bagi perkembangannya. Sebagai conth jaringan epitelia dapat terdiri dari satu atau beberap lapisan sel yang telah berkembang dan membantuk lapisan penutup, jenis jaringan lainnya, jaringan otot terdiri dari sel-sel yang reka membentuk otot (Gunarso, 1989).
Sel adalah bagian yang merupakan penyusun dasar suatu jaringan, dan pada kenyataannnya merupakan bagian dari semua makhluk hidup. Suatu sel dapat merupakan organisme yang lengkap, ataupun sejumlah sel dapat bergabung membentuk suatu jaringan, kombinasi penyusunnya membentuk orga-organ. Bentu-bentuk kehidupan berderajat tinggi sekalipun dimulai dari satu sel. Bila suatu organisme hanya teridiri dari satu sel, maka dinamakan Organisme Uniseluler. Sedangkan yang terbentuk oleh kumpulan sel-sel yang berbeda fungsinya dinamakan Organisme Multiseluler (Gunarso, 1989).
JENIS BAHAN SEDIAAN DAN CARA PENGAMBILAN SPESIMEN
Jenis Bahan Sediaan
Setiap organisme hidup ataupun hasil pertumbuhannya merupakan suatu sumber yang penting sebagai bahan mikoteknik. Bakteri serta berbagai jenis organisme uniseluler lainnya dapat termasuk di dalamnya, karena mereka sangat sering dijumpai erat hubungannya baik dengan jenis jaringan yang masih hidup maupun yang telah mati.
Untuk klasifikasi praktis, bahan yang berasal dari hewan atau tumbuh-tumbuhan dapat dibedakan sebagai bahan yang lunak dan keras, normal atau yang bersifat patologis. Suau spesimen mungkin saja berisi campuran jaringan lunak dan keras, sedang bagian darinpadanya dapat normal dan bagian lain justru patologis sifatnya seperti halnya tumor pada tulang. Pada umumnya suatu jaringan lunak dapat diproses untuk pembuatan sayatan tanpa perlakuan khusus guna mengeluarkan atau melunakkan bagian-bagian yang keras. Dari sekian banyak jaringan hewan, maka kelanjar, tulang rawan yang tidak berkalsium, kulit, otot, saraf dan saluran darah adalah contoh-contoh jaringan lunak. Sedangkan tulang gigi, tulang rawan berkalsium, kitin dan berbagai struktur pada kulit seperti sisik, tangkai bulu dan lempengan kapur termasuk jaringan keras.
Jaringan tumbuhan berbeda dengan jaringan hewa dalam satu hal penting, yaitu bahwa setiap sel tumbuhan terbungkus dalam membran yang cukup tangguh yang terutama terdiri dari selulosa. Membran tersebut berasal dari sel, sedang membran sitoplasma yag asli, yang sesuai dengan membran luar pada sel hewan, berada sedikit di sebelah dalamnya (Gunarso, 1989).SPESIMEN
Cara Pengambilan Spesimen
Spesimen berasal dari hewan maupun tumbuhan besar biasanya dipotong dalam ukuran yag sesuai untuk dipakai pada penyayatan selanjutnya. Untuk keperluan tertentu seringkali diperlukan spesimen berukuran dalam centimeter, namun spesimen dalam ukuran kecil akan memberikan hasil yang lebih baik.
Pada waktu membedah dan memisahkan spesimen dari jaringan.organ dan organisme,hendaknya dilakukan dengan hati-hati untuk menghindarkan terjadinya luka,kerusakan maupun sobekan.pemotongan sebaiknya menggunakan pisau silet bermata satu. Jika skalpel yang dipakai, gunakanlah skalpel yang tajam. Bila menggunakan gunting untuk memotong, maka tempat pemotongan biasanya terjadi kerusakan yang memerlukan trimming (perautan) sedikit demi sedikit dengan silet (Gunarso, 1989).
Spesimen berasal dari hewan
Jaringan hewan dapat diambil dari mahluk tersebut selagi masih dalam keadaan hidup,setelah mengalami pembiusan maupun yang baru saja mati dan segera mungkin dimasukkan larutan fiksatif.organ-organ yang halus sifatnya seperti hatu,jantung,buah pinggang maupun testis tikus atau kelinci dapat secara utuh langsung dimasukkan kedalam larutan fiksatif sebelum dipotong atau disayat dalam ukuran yang sesuai.Untuk usus,bila dikehendaki pemotongan dengan ukuran lebih dari satu sentimeter panjangnya,maka sebaiknya dilakukan penginjeksian larutan fiksatif kedalam lumen usus tersebut agar lapisan mukosa di dalamnya dapat terfiksasi dengan baik.Jenis otot maupun saraf sebaiknya direntang pada waktu fiksasi.Untuk itu,dapat dipakai misalnya batang gelas berbentuk U.tulang vertebrata yang berukuran kecil dapat difiksasi secara utuh,sedang untuk yang berukuran besar, agar dapat mengawetkan sumsum di dalamnya dengan baik,sebaiknya dilakukan pemotongan baik melintang maupun membujur berukuran 5-10 mm terlebih dahulu.cairan fiksatif mengandung formalin atau yang mengandung 5-10 % larutann formalin sudah cukup sesuai untuk memfiksasikan tulang maupun jenis jaringan yang memerlukan proses dekalsifikasi.formalin mempunyai daya penetrasi yang baik dan melindungi bagian-bagian yang lembut terhadap daya kerja cairan pendekalsifikasi yang digunakan (Gunarso, 1989).
Spesimen berasal dari tumbuhan
Spesimen tumbuhan yang sedang tumbuh maupun yang sedang dalam proses perkembangannya dapat diperoleh langsung dari rumah kaca,kebun maupun ladang. Botol berisi larutan fiksasi harus dipersiapkan pada waktu pengambilan atau pengumpulan spesimen. Dapat pula tumbuhan atau bahan daripadanya secepatnya disimpan dalam air sebelum dilakukan proses fiksasi. Banyak jenis tumbuhan yang langsung layu begitu dipotong. Untuk hal ini sebaiknya selalu disiapkan cairan fiksatif pada waktu pengumpulan bahan spesimen tersebut (Gunarso, 1989).
Jenis jaringan Patologis
Penyakit akan menyebabkan terjadinya kelainan pada jaringan.kelainan yang terjado tersebut merupakan hal yang penting pada penelaahan patologis. Baik spesimen hewan maupun tumbuhan umumnya memerlukan penelaahan secara mikroskopis untuk dapat mengidentifikasikan jenis penyakit yang menyebabkan kelainan patologis tadi. tumor dan infeksi merupakan penyebab utama terjadinya kelainan pada jaringan. Tumor pada manusia,hewan maupun tumbuhan umumnya tidak menular pada manusia. Sehingga tidak berbahaya dalam menanganinya. Bagian utama atau tertua sesuatu tumor biasanya merupakan jaringan yang sudah mati atau dalam proses kematian,sehingga bagian tersebut bukan merupakan bagian yang baik untuk menelaah perbedaan pertumbuhan normal dan tidak normal.
Dari embrio hewan dimungkinkan untuk mandapat hasil mikroteknik yang baik. Melalui sayatan melintang embrio tersebut dapat dilakukan penelaahan berbagai jenis jaringan (otot,saraf,epitelia,penghubung) sebagaimana cara yang terdapat pada hewan dewasa. Embrio berukuran kecil dapat difiksasi secara utuh. Embrio mamalia umumnya dikeluarkan dari rahim dan selaput pembungkusnya untuk kemudahan dimasukkan ke dalam cairan fiksatif. Embrio jenis hewan piaraan (babi,kambing dan lain-lain) pada tahap akhir (tahap fetal),akan selalu besar untuk difiksasi secara utuh sehingga memerlukan pemilihan dan penyayatan bagian jaringan yang dikehendaki. embrio tikus dan mencit memungkinkan untuk difiksasi secara utuh baik pada tahap fetal maupun yang baru lahir (Gunarso, 1989).
METODA MIKROTEKNIK
Metoda yang secara umum yang digunakan dalam mikroteknik adalah :
Sediaan utuh (Whole mounts)
Menurut (Joyner, 2008 dalam zaifbio 2010) Whole mounth merupakan metode pembuatan preparat yang nantinya akan diamati dengan mikroskop tanpa didahului adanya proses pemotongan. Jadi pada metode ini, preparat yang diamati adalah preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan, organ maupun individu. Gambar yang dihasilkan oleh preparat whole mounth ini terlihat dalam wujud utuhnya seperti ketika organisme tersebut masih hidup sehingga pengamatan yang dapat dilakukan hanya terbatas terhadap morfologi secara umum saja. Metode pembuatan preparat yang digunakan untuk pengamatan secara menyeluruh, artinya mempelajari struktur vegetatif dan reproduktifnya tanpa melakukan penyayatan terhadap tanaman tersebut karena metode ini menggunakan semua bagian tanaman sebagai preparatnya. Tentu saja tanaman yang diamati haruslah berukuran kecil sehingga dapat termuat pada objek glass. Sedangkan pada tanaman yang agak besar bisa dilakukan pemangkasan agar menjadi lebih rapi dan kecil. Metode whole mounth mempunyai kelebihan dan kelemahan masing-masing. Kelebihan metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian tanaman dengan jelas tiap bagian-bagiannya. Sedangkan kelemahannya adalah metode ini hanya bisa dilakukan pada tanaman dengan ukuran yang kecil saja tidak bisa tanaman yang besar sehingga metode ini perlu terus dikembangkan dengan melakukan bebagai percobaan (Gunarso, 1989).
Sediaan irisan (sectioning)
Pengirisan atau penyayatan umumnya dilakukan dengan bantuan mikrotom, walau seringkali dilakukan penyayatan dengan tangan saja untuk jenis spesimen seperti tulang, gigi ataupun benda-benda fosil seringkali diperlukan gergaji untuk memotongnya. Mikrotom adalah jenis mesin khusus dirancang dan dipasarkan untuk tujuan mikroteknik. Mesin tersebut dirancang sedemikian rupa sehingga mampu untuk melakukan penyayatan sesuatu spesimen dengan ketebalan yang sama atau paling kurang mendekati sama (Gunarso, 1989).
Sediaan uraian (teasing)
Pengertian teasing adalah menguaraikan. Untuk dapat memisahkan komponen suatu jenis jaringan maupun organ tisu atau jaringan diuraikan dengan menggunakan jarum penguraian. Dengan demikian pengertian teasng ini berarti juga pembedahan dalam skala kecil. Tingkatnya pada pembedahan biasa dan pembedahan mikro yang dilakukan dengan menggunakan jarum pengurai. Teasing ini dilakukan pada jenis sediaan segar yang telah difiksasi dan mengalami pewarnaan.
Selain itu masih ada pula dikenal beberapa metoda lain seperti :
1. Sediaan rentang (spreading preparation)
2. Sediaan gosok – sediaan remasan (squash)
3. Sediaan supravital.
METODE PARAFIN
Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu tumbuhan ataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini ialahirisan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin.Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifatseri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini.Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada jaringan akan larutdengan menggunakan metode ini (Gunarso, 1989).
Metode ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik dengan menggunakan metode ini. Metode parafin adalah suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan hewanataupun tumbuhan yang tipis. Preparat parafin ini dilakukan penyelubungankarena jaringan merupakan bahan yang lunak (Gunarso, 1989). Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnyasama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan. Pertama–tama organ yangakan dijadikan preparat diisolasi terlebih dahulu, kemudian difiksasi minimal 24 jam, didehidrasi dengan alkohol bertingkat selama 30 menit, diclearing denganxilol murni juga selama 30 menit, diinfiltrasi agar parafin yang masuk berfungsisebagai penyangga jaringan saat diiris dengan mikrotom, lalu diembedding(proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke dalam parafin cair, dan parafinakan masuk ke seluruh bagian jaringan, proses pemotongan dengan mikrotom, penempelan pada kaca objek, pewarnaan dengan haematoksilin (pada umumnya bahan ini yang sering digunakan untuk jaringan hewan) sedangkan jaringantumbuhan seringkali menggunakan safranin ataupun fast green. Setelah diwarnailalu dimounting, diberi perekat entellan, dan diberi label nama (Gunarso, 1989).Alat khusus yang dirancang untuk menyayat material atau jaringan dalamsayatan-sayatan yang cukup tipis untuk penelaahan dengan mikroskop adalahmikrotom. Syarat memperoleh hasil sayatan yang baik :1. Jaringan yang telah dipersiapkan dengan sempurna2. Pisau yang cukup tajam3. Pemilihan jenis mikrotom yang tepat4. Operator yang cukup terampil dan terlatih (Imran, 2010).
Metode parafin termasuk metode irisan yang merupakan metode rutin atau standar. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan normal sifatnya maupun yang mengidap suatu penyakit (patologis) akan lebih baik hasilnya dilakukan dari preparat jaringan yang telah dipersiapkan dengan baik, telah dillakukan penyayatan cukup tipis serta diberi pewarnaan yang sesuai, sehingga berbagai elemen yang diteliti lebih mudah untuk diamati (Gunarso, 1989). Adapun tahapan pembuatan preparat metode parafin adalah sebagai berikut :
Sampling
Merupakan proses awal dalam metode parafin. Pada sampling ini diambil beberapa organ sesuai keperluan. Jika organ terlalu besar maka dipotong-potong terlebih dahulu.
Menurut Eching (2009) Pengambilan jaringan :
a) Harus secepatnya di ambil terutama pada kadafer
b) Pemotongan harus dengan pisau yang tajam
c) Ukuran potongan sebaiknya 1 cm
d) Secepatnya difiksasi
Tujuannya untuk mencegah terjadinya perubahan-perubahan pasca mati dan perubahan struktur lain yang dapat menyesatkan dalam pengamatan.
Fiksasi
Tujuan utama fiksas adalah memberikan perlakuan tertentu terhadap elemen-lemen jaringan, terutama inti sel atau nukleinya, sehingga dapat diwetkan dalam kondisis yang sedikit banyak mendekati keadaan aslinya. Selain itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim yang terkandung dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis. Dengan kata lain fiksasi bertujuan :
Mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan aslinya.
Mencegah autolisis
Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras yang merupakan komponen cairan fiksatif.
Dehidrasi
Dehidrasi adalah proses mengeluarkan air dari dalam jaringan tisu dengan menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi merupaka langkah penting yang memerlukan perlakuan yang prosesnya tidak terputus-putus. Kesalahan yang terjadi akan mengakibatkan terhalangnya proses penamanan dalam parafin yang merupakan proses lanjutan setelah proses dehidrasi tersebut. Sehubungan dengan hal itu maka dehidran yang kita gunakan hedaklah memenuhi beberapa persyaratan sebagai berikut:
Harus mampu menarik air dari tisu menggantikan kedudukan air tersebut.
Dehidran itu sendiri dapat digantikan kedudukannya oleh meduium penjernih.
Tidak merusak dan mengganggu tisu yang telah difiksasi sebelumnya sehingga misalnya tisu akan menjadi terlalu lunak kembali ataupun malah memperkeras tisu tersebut menjadi rapuh.
Penjernihan (Clearing)
Tujuan utama proses penjernihan adalah menggatiakn tempat alkohol dalam tisu yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih menjelang proses penanaman sebelum dilakukan proses penyayatan. Setelah kita menggunakan xylol atau benzene pada proses penjernihan ini, pada umumnya tisu akan menjadi transparan : hal ini yang menjadi alasan bahwa hal ini dikenal sebagai proses penjernihan. Lama tisu dalam medium penjernih bergantung pada :
Ketebalan serta tingkat kepadatan tisu
Jenis reagen yang dipakai
Untuk jenis tisu yang melalui proses dehidrasi dengan sempurna, maka proses penjernihan (xylol, benzene) berlangsung selama setengah hingga tiga jam. Bila tisu dibiarkan cukup lama dalam medium penjernih ini, maka besar kemungkinan tisu akan menjadi keras dan rapuh yang tentu menyukarkan dalam penyayatan.
Infiltrasi (Infiltration)
Yang dimaksud dengan infiltrasi yaitu usaha menyususpkan media penanaman kedalam tisu dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih. Media penamanam/embedding yang umum dipakai adalah parafin. Parafin dibedakan berdasarkan titik didihnya, jadi ada yang bertitik didih 48°C, 54°C, 56°C dan 58°C. Utuk jenis tisu hewan yang biasanya digunakan parafin bertitik didih 58°C. Sebelum jaringan masuk kedalam parafin murni maka tisu terlebih dahulu berada dalam xylol : arafin dengan perbandingan 1:3, 1:1, 1:3 da selanjutnya masuk kedalam parafin murni.
Penanaman (embedding)
Penanama merupaka proses memasukkan atau menanam tisu kedalam blok-blok parafin (cetakan) sehingga memudahkan pada proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Beberapa teknik percetakan tersebut menggunakan :
a. Cetakan terbuat dari timah atau logam berat lainnya yang berbentuk L dialas kaca, dengan cara ini satu persatu tisu akan dapat dicetak.
b. Cetakan terbuat dari kertas. Sebaiknya disiapkan dari bahan kertas karton atau manila
c. Cetakan berbentuk bak yang terbuat dari aluminium, dengan cara ini tisu dapat ditanamkan sekaligus.
Pemotongan (section)
Proses penyayatan mencakup berbagai cara akan menghasilkan sayatan tipis tisu baik yang telah mengalami proses penanaman maupun tidak. Dalam mikroteknik, cara lazim digunakan adalah penyayatan dengan menggunakan mikrotom dengan berbagai peralatan pembantu seperti pisau mikrotom, kuas bulu, spatula, gunting serta pensil penoreh.
Mikrotom Alat khusus yang diracang untuk menyayat material atau tisu-tisu dengan sayatan-sayatan yang cukup tipis untuk penelaahan dengan mikroskop. Untuk memperoleh hasil sayatan yang baik dibutuhkan beberapa persayaratan sebagai berikut :
1. Tisu (jaringan) yang telah dipersiapkan dengan sempurna
2. Pisau yang cukup tajam
3. Pemilihan jenis mikrotom yang tepat
4. Operator yang cukup terampil dan terlatih
Afiksasi (afixing)
Afiksasi atau proses perlekatan adalah proses perlekatan atau penetapan sayatan tisu yang pada kaca preparat dengan bantuan media prekat tertentu. Pada proses ini diperlukan berbagai persiapan antara lain :
a. Kaca preparat bersih
b. Media prekat
c. Akuades
d. Meja pemanas/hot plate
e. Peralata berupa pinset, skapel, gunting, kuas dan lain sebagainya.
Deparafinisasi
Deparafinisasi adalah proses penghilangan parafin menggunakan xylol. Adapun langkah-langkah deparafinisasi adalah :
Jaringan dimasukkan kedalam xylol (xylol 1 dan xylol 2) masing-masing selama 30 menit
Redehidrasi dengan alkohol dari tinggi ke rendah (100%, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) kemudian cuci dengan air mengalir setelah itu celupkan ke dalam akuades.
Pewarnaan (staining)
Pewarnaan bertujuan agar dapat mempertajam atau memperjelas berbagai elemen tisu, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop. Motoda pewarnaan yang sering dilakukan dalam pembuata preparat metode parafin adalah metoda pewarnaan Hematoxilin-eosin.
Seperti merupakan peraturan, hamatoxillin digunakan terlebih dahulu dan setelah melalui proses diferensiasi, maka barulah eosin digunakan. Pertukaran tempat keduanya tampaknya akan menimbulkan kesukaran, karena pewarna hematoxilin akan mewarnai lebih cepat dari pada pewarna paduannya yang umumnya berperan sebagai counterstain yang intensitas pewarnaanya dapat diatur tanpa mempengaruhi pewarnaan hematoxilin. Adapun langkah-langkah pewarnaan adalah :
a) Dilakukan dengan pewarnaan hematoxilin selama 13 detik
b) Cuci dengan air mengalir
c) Bilas dengan akuades
d) Masukkan kedalam alkohol 30%, 40%, 50%, 60% da 70%
e) Bilas dengan akuades
f) Warnai dengan eosin selama 1-2 menit
g) Celupkan kedalam xyloll (xylol 1 dan xylol 2) masing-masing selama 20 menit.
Mounting
Merupakan proses akhir dari pembuatan preparat metoda parafin. Sebelum ditutup secara permanen maka sebaiknya jaringan dilihat pada mikroskop apakah jaringan tersebut sudah dapat diamati dengan baik atau tidak. Pada mounting tutup dengan canada balsem dan gelas penutup. Hindari terbentuk gelembung udara kemudian beri label dan diamati kembali dibawahh mikroskop.
CLEARING (PENJERNIHAN)
Clearing merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari penjernihan ini adalah menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman dalam paraffin. Medium penjernih ini akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya.
Lama jaringan dalam medium penjernih tergantung pada:
1. Ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan
2. Jenis reagen yang dipakai
3. Bila dehidrasi telah sempurna, maka lamnya xilol atau benzene adalah setengah hingga tiga jam. Bila dibiarkan cukup lama dalam penjernih, maka jaringan akan mengeras dan rapuh yang tentunya sulit untuk di sayat.
4. Jenis jaringan, seperti syaraf atau kelenjar limfa sebaiknya penjernih dalam menggunakan minyak cadar atau kloroform, karena jaringan tersebut cenderung menjadi keras atau getas bila dijernihkan dengan xilol atau benzene.
Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagi penjernih:
1. minyak anilin
2. Benzene
3. karbon tetraklorida
4. karbon bisulfida
5. minyak kayu cadar
6. kloroform
7. minyak cengkeh
8. Xylol
Untuk memungkinkan paraffin dapat masuk ke dalam sel, haruslah alkohol di dalam organ diganti dengan zat yang mudah mengusir alkohol tetapi kemudian harus bisa diusir oleh paraffin. Clearing atau dealkoholisasi ini dapat menggunakan aceton, benzol,toluol, dan xilol. Clearing dapat dilakukan selama 24 jam (Jvetunud, 2008).
Proses clearing tujuannya adalah untuk menarik dehidran dari dalam jaringan, agar nantinya dapat digantikan oleh molekul parafin. Jenis-jenis media penjernih adalah xilol, benzene, minyak anilin, karbon tetraklorida, karbon bisulfida, minyak kayu cedar, kloroform, minyak cengkeh. Setelah menggunakan xilol atau benzene, pada umumnya jaringan akan menjadi transparan, hal ini menjadi alasan maka proses ini disebut juga penjernihan. Jika dehidrannya alkohol, proses ini juga disebut dealkoholisasi. Lama jaringan berada dalam medium penjernih tergantung pada : Ketebalan serta tingkat kepadatan jaringan, Jenis bahan kimia yang dipakai (Johansen, 1940). Jenis media penjernih yang sering digunakan adalah xilol. Adapun kelebihan dari xilol adalah umum digunakan, murah, bekerja cepat, membuat jaringan cepat menjadi transparan, cepat menggantikan kedudukan dehidran, cepat digantikan tempatnya oleh parafin dan cepat pula menggantikan kedudukan parafin dalam proses deparafinisasi selama pewarnaan. Namun xilol juga terdapat kekurangan yaitu, dapat menyebabkan pengerutan jaringan yang dibuat, pengkerutan jaringan ini dapat mengakibatkan tidak sempurnannya dalam tahap pengamatan. Waktu yang diperlukan untuk proses ini relatif lama yaitu adalah ½ hingga 3 jam tergantung jenis jaringan yang dibuat. Jika terlalu lama di rendam dalam larutan xilol maka hal tersebut akan menyebabkan jaringan menjadi kering, rapuh, dan getas sehingga hasil akhir dari pembuatan sediaan yang telah jadi tidak akan bertahan lama(Swenson,1970).Jenis jaringan yang keras sipatnya,seperti tulang,gigi,kukudan beberapa lainnya mungkin sekali sangat sukar untuk dibuat sediaan sayatan (kecuali bila mengalami berbagai perlakuan khusus sebelumnya).untuk menggosok, tulang misalkan tulang paha terlebih dahulu dipotong – potong hingga bberukuran beberapa mili hingga 1-2 cm (tergantung jenis potongan melintang atau membujuur). Potongan atau serpihan tersebut kemudiaan digosok pada batu gosok atau jenis lainnya hinggaa cukup tipis untuk dapat diamati pada mikroskop,setelah terlebih dahulu diberi zat warna.
Gambar 1. Clearing dengan reagen yang membuat jaringan menjadi transparan.
(sumber : http://www.biotechniques.com/news/Making-Tissue-Transparent-with-Urea/biotechniques-325032.html)
Gambar 2. Jaringan embrio sebelum dan sesudah proses Clearing
(sumber : http://dev.biologists.org/content/140/6/1364/F1.expansion.html)
BAB III
KESIMPULAN
Berdasarkan penjelasan diatas, kesimpulan yang didapat dari makalah ini yaitu :
Mikroteknik atau teknik histologi merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah.
Metoda yang secara umum yang digunakan dalam mikroteknik adalah :
Sediaan utuh (Whole mounts)
Sediaan irisan (sectioning)
Sediaan uraian (teasing)
Sediaan ulasan (smearing)
Selain itu masih ada pula dikenal beberapa metoda lain seperti :
Sediaan rentang (spreading preparation)
Sediaan gosok – sediaan remasan (squash)
Sediaan supravital
Pembuatan preparat dengan metode paraffin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat permanent, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan.
Tujuan dari penjernihan (Clearing) adalah menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman dalam paraffin. Medium penjernih ini akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya.
DAFTAR PUSTAKA
Budiono, J.D. 1992. Pembuatan Preparat Mikroskopis. University Press. IKIP. Surabaya.
Gunarso, Wisnu. 1989. Bahan Pengajaran Mikroteknik. Bogor : DEPDIKBUD Institiut Pertanian Bogor
Amar. 2008. Materi Mikroteknik. http://amar1286.multiply.com/journal/item/10 (di unduh tanggal 4 April 2015)
Zaifbio. 2010. Preparat Wholemount Kutu Daun Bunga (Triboliun Confusum).
http://zaifbio.wordpress.com/category/mikroteknik/ (diakses tanggal 4 April 2015)
Kusumawati, Diah. 2004. Bersahabat Dengan Hewan Coba. Gadjah Mada Press.Yogyakarta.
Eching.2009. Mikroteknik. http://yessyrumengan.blogspot.com/2009/11/histologi- mikroteknik.html (diakses tanggal 4 April 2015).
Wahyudi. 2012. TEORI MIKROTEKNIK SEMESTER V MIPA UNHI.
http://wahyudikeneddy.blog.com/2012/10/26/teori-mikroteknik-semester- v-mipa-unhi/ (diakses tanggal 4 April 2015)
Ningtyas. Rina. 2011. Laporan Mikroteknik.
http://rinaningtyasbiology.blogspot.sg/2011/01/lap-mikroteknik.html
(diakses tanggal 4 April 2015)
