NTC 4779

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4779 (Primera actualización) 2007-08-29

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES METODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE ESTAFILOCOCOS ES TAFILOCOCOS COAGULASA-POSITIVA (Staphylococcus aureus Y OTRAS ESPECIES) 1. OBJETO Esta norma específica los métodos horizontales para el recuento de estafilococos coagulasa positiva en productos destinado al consumo humano o para la alimentación de animales, mediante el recuento de colonias obtenidas en medio sólido medio Baird-Parker o medio plasma de conejo fibrinógeno como medio alternativo véase el anexo B (Informativo)] después de incubación aeróbica a 36 °C ± 2 ºC.

2- REFERENCIAS NORMATIVAS Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado (incluida cualquier corrección). NTC 4002. Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Requisitos generales para el examen microbiológico (ISO 7218). NTC 4491-1, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales, preparación de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiólogos. Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales (ISO 6887-1). NTC 4491-2. Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 2. Reglas específicas para la preparación de carne y productos cárnicos (ISO 6887-2). NTC 4491-3, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación demuestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los

análisis microbiológicos. Parte 3. Reglas específicas para preparación de muestras de pescado y productos de la pesca (ISO 6887-31). NTC 4491-4. Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 4.Reglas específicas para la preparación de productos diferentes de leche, productos lácteos, carne, productos cárnicos, pescado y productos de la pesca (ISO 68874).

3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES Para los propósitos de esta norma se aplican los siguientes términos y definiciones:

3.1 Estafilococos coagulasa-positiva. Bacteria esférica aeróbica. Gram (+), que aparece aislada, formando parejas, tétradas o agrupadas en racimos, inmóviles, capaces de coagular el plasma, convirtiendo el fibrinógeno en fibrina siguiendo el método especificado en esta norma.

3.2 Recuento de estafilococos coagulasa-positiva. Determinación del número de estafilococos coagulasa-POSITIVA coagulasa-POSIT IVA encontrados por mililitro o por gramo de muestra cuando el ensayo se lleva a cabo de acuerdo con el método especificado en esta norma. 4 PRINCIPIO

4.1 Se inocula en la superficie de un medio de cultivo selectivo sólido, usando cajas de petri por duplicado, una cantidad específica de muestra de ensayo.

4.2 Se incuba las cajas en condiciones aeróbicas a 35 °C ± 1 ºC y se realiza la lectura a las 24 h y 48 h.

4.3 Se calcula el número de estafilococos coagulasa-positiva por mililitro, o por gramo, de muestra a partir del número de colonias típicas, colonias atípicas, o ambas, obtenidas en cajas de los niveles de dilución escogidos de tal forma que de un resultado significativo, y confirmado con el resultado positivo de la prueba de la coagulasa.

5. DILUYENTE Y MEDIO DE CULTIVO 5.1 GENERAL Para la práctica actual de laboratorio, Véase la NTC 4092.

5.2 DILUYENTE Véanse las NTC 4491-1, NTC 4491-2. NTC 4491-3, NTC 44914 y la norma específica relacionada con el producto a examinar.

5.3 MEDIO BAIRD-PARKER BAIRD-PARKER Se puede usar medios de cultivo comercialmente disponibles. En tal caso, deben seguirse cuidadosamente las instrucciones del fabricante.

5.3.1 Medio base 5.3.1.1 Composición Caseína por digestión pancreática Extracto de lavadura Extracto de carne Piruvato de sodio L-Glicina Cloruro de litio Agar Agua Dependiendo de la fuerza del gel del agar

10,0 g 1,0 g 5,0 g 12,0 g 12,0 g 5,0 g 12 g a 22g 1 000 ml

5.3.1.2 Preparación -

Se disuelven los componentes de la base completa deshidratada en agua hasta ebullición. Se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilización sea de 7.2 ± 0,2 a 25°C.

Se transfiere el medio en cantidades de 100 ml a Erlenmeyer á frascos (Véase el numeral 6.5) de capacidad apropiada. Se esteriliza el medio por 15 min a 121 °C.

5.3.2 Soluciones 5-3.2-1 Solución de telurito de potasio 5.3.2.1.1 Composición

Telurito de potasio ( k2TeO3) 1.0 g Agua destilada destilada o des ionizada ionizada 100ml Se recomienda asegurarse previamente de que el telurito de potasio disponible es apropiado para este ensayo (Véase el numeral 5.3.2.1.2)

5.3.2.1.2 Preparación

-

Se disuelve el telurito de potasio en el agua calentando lentamente hasta disolución completa. El sólido debe ser soluble. Si se presenta material blanco insoluble, se descarta el reactivo, Se esteriliza por filtración usando membranas con tamaño de poro de 0,22 µn. La solución puede ser almacenada como máximo por un mes a 3°C ± 0,2 °C. Se descarta la solución si se forma un precipitado blanco.

5.3.2.2 Emulsión de yema de huevo (concentración aproximada del 20% o de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Se usan huevos de gallina con las cáscaras intactas que tengan menos de siete días. Se lavan los huevos con un cepillo en detergente líquido. Se enjuagan con agua corriente, luego se desinfectan sumergiéndolos en etanol al 95 % (V/V) durante 30 s o etanol al 70 % durante 1 h y se secan. Empleando procedimientos asépticos, se rompe cada huevo y se separa la yema de la clara. Se colocan las yemas en una probeta estéril para su medición y se añaden 4 partes por volumen de agua estéril y/o solución salina al 0.85 %. Se transfiere asépticamente a un matraz estéril y se mezcla vigorosamente. Se calienta la mezcla por 2 h en un baño de maría a 45 °C. Luego se deja por 18 h a 24 h a una temperatura a 3°C± 2°C para permitir que se forme un precipitado. Se retira asépticamente el sobrenadante. La solución debe ser en lo posible utilizada en su totalidad. Se adiciona, bajo condiciones asépticas, la yema de huevo. Se mezcla bien después de cada adición mediante rotación para minimizar la formación de espuma. Servir inmediatamente en las cajas de petri.

5.3.2.3 Solución de Sulfamezatina (sulfametazina, sulfadimidina) 5.3.2.3.1 Composición Sulfamezatina Solución de hidróxido de sodio (NaOH)- 0,1 MOL/L Agua destilada destilada o des ionizada ionizada

0.2 g 10ml 90 ml

5.3.2.3.2 Preparación -

Se disuelve la sulfametazina en la solución de hidróxido de sodio. Se completa hasta 100 ml con agua. Se esteriliza por filtración usando membranas con un tamaño de poro de 0.22 µm.

-

La solución solución puede ser almacenada como máximo máximo por un mes a 3°C± 3°C± 2°C.

5.3.3 Medio completo 5.3.3.1 Composición Medio base (Véase el numeral 5.3.1) Solución de telurito de potasio (Véase el numeral 5.3.2.1 ) Emulsión de yema de huevo (Véase el numeral 5.3.2.2) Solución de Sulfametazina

100ml 1,0ml 5,0ml 2,5ml

5.3.3.2 Preparación -

-

Se funde el medio, luego, luego, se enfría a 45°C± 2°C, mediante el baño maría. Se adiciona, bajo condiciones asépticas, las otras dos soluciones (si se sospecha que especies de Proteus están en la muestra de ensayo) la solución de sulfametazina (Véase numeral 5.3.2.3). siendo previamente calentadas en el baño de maría a 45°C± 1°C. se mezcla bien después de cada adición.

5.3.4 Preparación de las cajas Se coloca la cantidad apropiada de medio completo (véase el numeral 5.3.3) en cajas de Petri estériles para obtener un agar de 4 mm, de espesor aproximadamente, y se permite la solidificación. Las cajas pueden ser almacenadas, de 24 h hasta 72 h a 3 °C± 2°C.

NOTA Las instrucciones del fabricante sobre el periodo de almacenamiento deben seguirse para cajas preparadas industrialmente. Antes del del uso para para eliminar la condensación, condensación, se deben dejar dejar las cajas, cajas, con las tapas sueltas en un área aséptica.

5.4 CALDO INFUSIÓN CEREBRO-CORAZÓN 5.4.1 Composición Tejidos animales por digestión enzimática Infusión deshidratada de cerebro de ternero Infusión deshidratada de corazón de vaca Glucosa Cloruro de sodio Fosfato de sodio di básico, anhidro Agua destilada destilada o des ionizada ionizada

5.4.2 Preparación

10,0 g 12,5g 5,0g 2,0g 5,0g 5,0g 1 000ml

-

Se disuelven los componentes de la base completa deshidratada en agua por ebullición. Si es necesario, se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilización sea de 7.4 ± 2 a 25 °C. Se transfiere el medio en cantidades de 5 ml a tubos de ensayo o frascos (Véase el numeral 8.5) de capacidad apropiada Se esteriliza el medio por 15 min a 121 °C.

6. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO NOTA los equipos desechables son una alternativa aceptable al material reutilizable si tienen especificaciones apropiadas. Equipo microbiológico usual de laboratorio y en particular lo siguiente:

6.1 Equipos para esterilización en seco (horno) y para esterilización húmeda (autoclave) Véase la NTC 4092.

6.2 Incubadora, para mantener el medio inoculado, cajas y tubos de ensayo a un rango de temperatura de 35 °C± 2°C.

6.3 Baño de maría, o equipo similar, capaz de mantener la temperatura de 46 °C± 1°C y 48°C± 1°C.

6.4 Tubos de ensayo, Erlenmeyer o frascos con tapa rosca, de capacidad apropiada, para la esterilización y almacenamiento de medios de cultivo e incubación de medios líquidos: en particular tubos estériles de hemólisis, o tubos de fondo redondo de aproximadamente 10 mm x 75mm.

6.5 Cajas de Petri estériles, de vidrio o plástico. 6.6 Asa bacteriológica (Véase la NTC 4092) y pipeta Pasteur. de capacidades nominales de 1ml, 2 ml y 6.7 Pipetas graduadas de vaciado total, de 10 ml, graduadas en divisiones de 0.01 ml, 0.1 ml y 0.5 ml. respectivamente o micro pipetas.

6.8 Varillas de vidrio o plástico (Diglastic) rastrillos o varillas de Jockey, estériles. 6.9 pH-metro, con capacidad de lectura de 0,01 unidades de pH, permitiendo mediciones con una precisión de ± 0.1 unidades de pH.

7. MUESTREO Es importante que el laboratorio reciba una muestra representativa y adecuada para su correspondiente análisis y que no haya sufrido daños o cambios durante el transporte o el almacenamiento.

El muestreo no hace parte del método especificado en esta norma. Debe verse la norma específica para el producto en cuestión. Si no hay norma específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.

8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO Se prepara la muestra de acuerdo con la norma específica apropiada para el producto en cuestión. Si no existe una norma específica, se recomienda que las partes involucradas lleguen a un acuerdo.

9. PROCEDIMIENTO 9.1 PORCIÓN DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES Véase la NTC 4491-1, NTC 4491-2. NTC 4491-3. NTC 4491-4 y la norma específica para el producto en cuestión.

9.2 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN CUANDO SE EMPLEA MEDIO BAIRD PARKER (VÉASE EL NUMERAL 5.3.3) 9.2.1 Se transfiere por medio de una pipeta estéril [véase el numeral 6.8), 0.1 ml de la muestra de ensayo si es líquida, o 0.1 ml de la suspensión (dilución 10 -1) en el caso de otros productos a cada una de las dos cajas (véase el numeral 6.8). Se repite el procedimiento para la dilución 10 -2 y para las demás diluciones decimales si es necesario.

9.2.2 Si para ciertos productos, se espera contar bajo número de estafilococos coagulasa positiva, el límite de detección se puede incrementar por un factor de 10 inoculando 1,0 ml de la muestra de ensayo si es líquida o 0,1 ml de la suspensión para otros productos, tanto en la superficie de cajas de agar grandes (140 mm) o en la superficie de tres cajas de agar pequeñas pe queñas (90 mm). En ambos casos, se preparan duplicados usando 2 cajas grandes o seis pequeñas.

9.2.3 Cuidadosamente se esparce el inóculo tan rápido como sea posible sobre la superficie del agar tratando de no tocar los lados de las cajas, usando la varilla (véase el numeral 6.9). Se permite que las cajas se sequen con sus tapas por 1 min aproximadamente a la temperatura del laboratorio.

9.2.4 Se invierten las cajas preparadas de acuerdo con el numeral 9.2.3 y se incuban por 24 h a 48 h ± 2 h (véase el numeral 6.2) a 35°C ±2°C.

9.3 SELECCIÓN DE LAS CAJAS E INTERPRETACIÓN 9.3.1 Cuando se emplea Medio Baird Parker Véase el numeral 5.3.3

9.3.1.1 Después de la incubación por 24 h ± 2 h, se marca en la caja las posiciones de cualquier colonia típica presente (véase la Nota 2). Se re incuban todas las cajas a 35°C±2 °C por 24 h ± 2 h adicionales, y se marca cualquier nueva colonia típica. También se marca cualquier colonia atípica presente (véase la Nota 2 del numeral 9.4.1.1). Si se inoculó 1.0 ml sobre tres cajas (véase el numeral 9.2.2), considerarlas como una sola en todos los recuentos subsecuentes y procedimientos de confirmación. Para el recuento se toman solo aquellas cajas (véase la Nota 2 del numeral 9.4.1.1) que contengan entre 20 y 200 colonias típicas, atípicas, o ambas, en dos diluciones sucesivas. Para confirmación, (véase el numeral 9.5), se selecciona un número dado A (véase el numeral 10.1.1) (en general de 3 colonias a 5 colonias típicas, si solo hay colonas típicas, o de 3 a 5 colonias atípicas, si solo hay colonas atípicas, o de 3 a 5 colonias típicas y de 3 a 5 colonias atípicas si están presentes ambas, de cada caja). Si hay menos de 20 colonias típicas, atípicas, o ambas, presentes en las cajas inoculadas con el producto líquido no diluido o con la dilución menor de otros productos, es posible hacer un recuento estimado estima do como el descrito en los numerales 9.4.1.3 y 10.2. NOTA Las colonias típicas son negras o grises, brillantes y convexas (de 1 mm a 1.5 mm de diámetro después despué s de 24 h de incubación y 1.5 mm a 2.5 mm de diámetro diámet ro después de 48 h de incubación y rodeadas por una zona clara (halo) que puede ser parciamente opaca. Después de por lo menos 24 h de incubación puede aparecer en esta zoca clara, un halo claro opalescente, inmedi atamente en contacto con, las colonias. NOTA 2 Si para el análisis es el recuento de staphylococcus coagulasa positiva es necesario tener en cuenta las colonias típicas. Las colonas atípicas pueden presentar una de las siguientes morfologías: a) colonias negras brillantes con o sin un estrecho borde blanco: la zona clara está ausente o ligeramente visible y el halo opalescente está ausente o es apenas visible; b) colonias grises sin zonas claras. Las colonias atípicas están formadas principalmente por cepas de estafilococos coagulas positiva contaminantes, por ejemplo productos lácteos, camarones y vísceras de ave. Están formadas menos frecuentemente por cepas de estafilococos coagulasa-positiva contaminantes de otros productos. NOTA 3 Otras Otras colonias son el resto de colonias que pueden estar presentes en la placa y que no muestran la apariencia típica, consideradas como la flora de fondo.

Las bacterias pertenecientes perteneciente s a otros generes diferentes al staphylococos pueden dar colonias con una apariencia similar a los estafilococos. El examen microscópico con tinción de Gram antes de la confirmación, facilitara la diferenciación de otros géneros.

9.3.1.3 Para hacer un recuento estimado de número bajos de estafilococos coagulasa-positiva, se retinen todas las cajas que contengan colonias típicas y atípicas. Se seleccionan todas aquellas colonias para confirmación con los requisitos siguientes.

9.4 CONFIRMACIÓN (PRUEBA DE LA COAGULASA) De la superficie de cada colonia seleccionada (Véase el numeral 9.41), se remueve un inóculo con un asa estéril (Véase el numeral 5.5) y se transfiere a un tubo o frasco con caldo infusión cerebro-corazón (Véase el numeral 5.4) Se incuba a 35°C±2 °C por 24h ±2 h. Se adiciona asépticamente 0.1 ml de cada cultivo a 0.3 ml del plasma de conejo (véase el numeral 5.5) (a menos que se especifiquen otras cantidades por el fabricante) en tubos de hemólisis o frascos estériles (especificados en el numeral 6.5), y se incuba a 35 °C±2 °C se inclina el tubo, se examina el coágulo del plasma después de 4 h a 6 h de incubación y, la prueba es negativa, se re-examinan a las 24 h de incubación, o se examina a los tiempos de incubación especificados por el fabricante. Se considerará la prueba de coagulase positiva, si el volumen de coágulo ocupa desde un cuarto del volumen original del líquido. Como control negativo, para cada lote de plasma, se adicionan 0.1 ml de caldo infusión cerebro-corazón (véase el numeral 5.4) a la cantidad recomendada de plasma de conejo (véase el numeral 5.5) y se incuba sin inoculación. Para validar la prueba, el pasma de control no debe mostrar ningún signo de coagulación.

10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS 10.1 CASO GENERAL 10.1.1 Cálculo del número a de estafilococos coaguasa-positva identificados para cada caja seleccionada. Se calcula para cada una de las cajas, el número a de estafilococos coagulasapositiva, de acuerdo con la ecuación:

= _____x En donde

+_____x

Ac = es el número número de colonias colonias típicas sometidas a la prueba coagulasa coagulasa (Véase el numeral 9.5)

Anc = es el número número de colonias colonias atípicas atípicas sometidas sometidas a la prueba prueba coagulasa coagulasa (Véase el numeral 9.5);

Bc = es el número de colonias típicas positivas para la prueba de la coagulasa;

Bnc = es el número de colonias atípicas positivas para la prueba de la coagulasa;

Cc = es el número total de colonias típicas vistas en la caja (Véase el numeral 9.4.1);

Cnc = es el número total de colonias atípicas vistas en la caja (Véase el numeral 9.4.1).

Se redondea el resultado con dos cifras significativas (véase la NTC 4092). 10.1.2 cálculo del número N de estafilococos coagulasa-positiva presentes en la porción de muestra. Para aquellas cajas que contienen como máximo 200 colonias, con 100 colonias típicas y/o atípicas en dos diluciones sucesivas, se calcula el número de estafilococos coagulasa-positiva para cada caja como se especifica en el numeral 10.1.1 se calcula, como un promedio ponderado de dos diluciones sucesivas, el número N de estafilococos coagulasa-positiva presentes en la porción de muestra, usando la siguiente ecuación:

=

∑ (1 + 0,1 0,1 2) 2)

En donde ∑a = es la suma de colonias de estafilococos coagulasa-positiva en todas las cajas seleccionadas; V = es el volumen del inoculo de cada caja, en mililitros;

N1 = es el número de cajas seleccionadas de la primera dilución. N2 = es el número de cajas seleccionadas de segunda dilución; D = es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución seleccionada (la suspensión inicial es una dilución)

Se redondea el resultado calculando con dos cifras significativas (véase la NTC 4092) Se reporta el resultado como el número de estafilococos coagulasa-positiva por mililitro (productos líquidos) o por gramo (otros productos), expresado como un número entre 1.0 y 9,9 inclusive multiplicado por 10 x donde x es la apropiada potencia de 10.

10.1.3 Ejemplo El recuento para un producto después de incubación con 0.1 ml de producto dio los siguientes resultados:

-

para la primera dilución (10 -2): 65 colonias típicas y 85 colonias atípicas: para la segunda dilución (10 -3): 3 colonias típicas y 7 colonias atípicas:

Se obtuvieron los siguientes números.

-

. de 65 colonias, 5 colonias colonias fueron seleccionadas seleccionadas y todas las 5 fueron coagulasa positiva, dando a = 65:

-

de 85 colonias, 5 colonias fueron seleccionadas, 3 de las cuales fueron coagulasa positiva, dando a= 51

-

de 3 colonias, todas las 3 fueron coagulasa-positiva, dando a = 3:

-

de 7 colonias, 5 colonias fueron seleccionadas, y todas las 5 fueron coagulasa-positiva, dando a = 7.

-

=

65+51+3+7 = 57 272 (0.2 0.22 x 10 − 2)

El resultado, después de redondearlo, es 5, 7 x 10 -4

10.2 ESTIMACION DE NUMEROS BAJOS

10.2.1 Si dos de las cajas, correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) o la suspensión inicial (otros productos) contienen menos de 20 colonias identificadas, se reportan los resultados como sigue.

a) Para productos líquidos, se estima el número N, de estafilococos coagulasapositiva por mililitro:

=

∑ 2

En donde ∑a = es la suma de colonias identificadas de estafilococos coagulasapositiva (Véase el numeral 10.1.1) en las dos cajas seleccionadas; V

=

es el volumen esparcido en cada caja.

c) Para otros productos, se estima el número N de estafilococos coagulasa-positiva por gramo:

=

∑ 2

en donde ∑a = es la suma de colonias identificadas de estafilococos coagulasapositiva (Véase el numeral 10.1.1) en las cajas seleccionadas;

D V

=

es el factor de dilución de la suspensión inicial; =

es el volumen esparcido en cada caja.

10.2.2 Si dos de las cajas, correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) o la suspensión inicial (otros productos) no contienen ninguna colonia de estafilococos coagulasa positiva y si el inóculo ha sido hecho con 0,1 ml demuestra, reportar los resultados como sigue (caso general de un inóculo de 0.1 ml):

-

menor de 10 estafilococos coagulasa-positiva por mililitro (productos líquidos): menor de 10/d estafilococos coagulasa-positiva por gramo (otros productos), donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial.

Si el inóculo ha sido hecho con 1 ml de muestra, se reportan los resultados como sigue:

-

menor de 1 estafilococos coagulasa-positiva coagulasa-posit iva por mililitro (productos líquidos): menor de 10/d estafilococos coagulasa-positiva por gramo (otros productos).

11. PRESICION 11.1 GENERALIDADES La precisión de los métodos cuantitativos puede expresarse en términos de repetitividad y reproducibilidad, según se define en Ia norma ISO 5725-2. Sin embargo, el método de cálculo utilizado en Ia noema ISO 5725-2, basado en la media, no siempre resulta apropiado para los análisis microbiológicos, que no siempre muestran una distribución normal (Gaussiana).Por consiguiente, se ha seguido la norma ISO 16140, que se ha desarrollado especialmente para los métodos microbiológicos y que utiliza estimadores robustos para calcular la repetibilidad y la reproducibilidad. Estas estadísticas presentan la ventaja de ser menos sensibles a los valores extremos, permitiendo por lo tanto conservar los datos discrepantes de los análisis estadísticos. Por tanto estos estimadores se utilizan en esta parte de la NTC 4779 (ISO 6888)

Los detalles de un análisis interlaboratorio respecto a la precisión del método se resumen en el Anexo A. Los valores obtenidos a partir de este análisis interlaboratorio pueden no resultar aplicables a rangos de concentraciones y matrices diferentes de las indicadas. Los datos de precisión se determinaron utilizando tres tipos de alimentos, contaminados a distintos niveles y para materiales de referencia. Factores tales como la cepa considerada, la flora competitiva y el estado fisiológico de los microorganismos blanco (Target) y de los competidores influyen sobre los valores de precisión.

11.2 REPETIBILIDAD 11.2.1 Limite de repetibilidad

La diferencia absoluta entre los resultados (transformados a log 10) de dos análisis individuales (número de estafilococos coagulasa-positiva por gramo o por mililitro), o Ia proporción entre el mayor y el menor de los dos resultados del anális is en escala normal, obtenidos utilizando el mismo método sobre idéntico material de análisis por el mismo analista, utilizando los mismos aparatos dentro del intervalo de tiempo lo más corto posible, no sobrepasará el límite de repetibilidad (r) en más del 5% de los casos.

11.2.2 Valores globales Como indicación general del límite de repetibilidad (r) pueden utilizarse los siguientes valores cuando se analicen muestras alimenticias en general. Estos valores de r son medias generales para todas las matrices consideradas: r = 3,28 (expresado como diferencia absoluta entre resultados de análisis transformados a log 10), o r = 1.9 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados del análisis, en escala normal). Para materiales de referencia (cápsulas que contienen aproximadamente 5000 UFC. (Véase el Anexo A), pueden utilizarse los siguientes valores: r = 0.19 (expresado como diferencia absoluta entre resultados de análisis transformados a log 10), o r = 1.55 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados del análisis, en escala normal). EJEMPLO. Se obtuvo un primer resultado de un análisis de 10 000 0 1.0 x 10 -4 estafilococos coagulasa-positiva por gramo de alimento. Bajo condiciones de repetibilidad, la relación entre el resultado del análisis más alto y el más bajo no debería ser mayor de 1.9. Por consiguiente, el resultado del segundo análisis debería estar entre 5 263 (=10 000 /1,9) y 19 000 (10 000 x 1,9) estafilococos coagulasa-positiva por gramo.

11.3 REPRODUCIBILIDAD 11.3.1 LÍMITE DE REPRODUCIBILIDAD La diferencia absoluta entre los resultados transformados a log 10) de dos análisis individuales (números de estafilococos coagulasa-positiva coagulasa-positi va por gramo o por mililitro), mililitro) , o la proporción entre el mayor y el menor men or de los dos resultados del análisis en escala esca la normal, obtenidos utilizando el mismo método sobre idéntico material de análisis en

laboratorios diferentes o por analistas diferentes del mismo laboratorio (Véase en Bibliografía la referencia [41). por analistas distintos que utilizan aparatos distintos, no sobrepasará el Límite de reproducibilidad (R) en más del 5 % de los casos.

11.3.2 Valores globales Como indicación general del límite de reproducibilidad (R) pueden utilizarse los siguientes valores cuando se analicen muestras alimenticias en general. Estos valores de R son medias generales para todas las matrices consideradas: R = 0,43 (expresado como diferencia entre resultados de análisis transformados a log10), o R = 2.7 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados del análisis, en escala normal). Para materiales de referencia (cápsulas que contienen aproximadamente 5 000 UFC. véase el Anexo A), pueden utilizarse los siguientes valores: R = 0.39 expresado como diferencia entre resultados de análisis transformados a log10), o R = 2.4 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados del análisis, en escala normal). EJEMPL0 1 En un primer laboratorio se obtuvo un resultado del análisis de e 1,1 x 10-4 estafilococos coagulasa positiva por grano de producto alimenticio . Bajo condiciones de reproducibilidad a relación entre los resultados de los análisis entre el primer y el segundo laboratorio no debería ser no tenerla ser superior a 2.7. Por consiguiente el resultado del siguiente laboratorio debería estar entre 3,7 x 10 3 = (1,0 x 10 4 /2,7) y 2,7 x10 4 = (1,0 x 10 4 x 2,7) estafilococos coagulasa-positiva por gramo. EJEMPLO 2 Un laboratorio quiere saber cuál es el nivel máximo que puede encontrar que aun este en conformidad con con el límite preestablecido preestableci do (por ejemplo un límite de 10 5 o de 5 unidades log 10). Para esto, el valor de R (en escala logarítmica) tiene t.ie multiplicarse por un factor te 0.59. Este valor es 0,25 (0,43 x 0.59) cuando se considere la diferencia entre los resultados de análisis transformados a log 10 o de 100,25 cuando se considere la relación entre resultados de análisis. Por consiguiente, resultados de hasta log 10, 5,25 (log 10 5 + log 10 0,25) o 1,8 x 10 5 no indican falta de conformidad por dicho límite. El factor de 0.59 refleja el hecho de que se utiliza un análisis por un intervalo de confianza mono direccional del 95 % para verificar si se supera el límite S .El factor de 0,59 se obtiene a partir de la siguiente formula.

0.59 =

1,65 1,96√ 1,96√ 2

Se añade el siguiente Anexo A tras la finalización del numeral 12

12. INFORME DE ENSAYO El informe de ensayo debe especificar: - toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra; - el método de muestreo utilizado, si se conoce; - el método de ensayo utilizado, con referencia a esta parte de la norma; - todos los detalles operativos no especificados en esta parte de la norma, o considerado como opcional, cualquier incidente detallado que pueda haber influenciado los resultados del ensayo; - el resultado obtenido.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4779 (Primera actualización)

ANEXO A (Informativo)

RESULTADO DE UN ESTUDIO NTERLABORATORIOS

Se organizó un estudio interlaboratorio internacional en 1999 a cargo del laboratorio para el Laboratory for Study and Research on Hygiene and Quality of Food (LERHQA) de la French Food Salety Agency (AFSSA), en el marco del proyecto Europeo SMT CT 96 2098 (véase la referencia [8] de la Bibliografía). En este estudio participaron 24 laboratorios laboratorio s de 16 países de Europa y se realizó sobre queso, carne, huevo en polvo y un material de referencia. Cada una de las muestras alimenticias se analizó en tres niveles de contaminación con Staphylococcus coagulasaPositivas, más un control negativo. Los datos de precisión obtenidos a partir de este estudio interlaboratorio se muestran para cada tipo de muestra en las Tablas A. 1 a A.4. Se han calculado utilizando estadísticas robustas, según se describe en la norma ISO 16140. Se han excluido de los cálculos los datos procedentes de algunos laboratorios cuando se sabía que se apartaban del protocolo de estudio descrito.

Tabla A.1. Resultados del análisis de datos obtenidos con muestras de queso Muestra/Nivel de contaminación

Queso nivel bajo

Queso nivel medio

Queso nivel alto

Número de laboratorios que proporcionaron resultados

22

22

22

Número de muestras por laboratorio

2

2

2

Número de laboratorios participantes tras eliminar a los discrepante

19

19

19

Número de muestras aceptadas

38

38

38

Valor medio (en log 10 C UFC/g)

3,33

5,12

6,06

Desviación estándar de la repetibilidad, s, (en 10gm) UFC/g)

0,18

0,06

0,12

Desviación estándar relativa de la repetibilidad (%)

5,36

1,16

1,96

Límite de repetibilidad (r), en forma de diferencia en escala de 10gw (en log1o UFC/g)

0,50

0,17

0,33

Desviación estándar de la reproducibilidad, sr (en log 10 UFC/g)

0,19

0,16

0,24

Desviación estándar relativa de la reproducibilidad (%)

5,61

3,24

3,91

Límite de reproducibilidad (R), en forma de diferencia en escala de log10 (en log10 UFC/g)

0,52

0,47

0,66

Tabla A.2. Resultados del análisis de datos obtenidos con muestras de carne

carne

carne

carne

nivel bajo

nivel medio

nivel alto


23

23

23


2

2

2


18

18

18


36

36

36

3,27

4,20

6,19


0,12

0,07

0,10


3,64

1,58

1,67

Muestra/Nivel de contaminación

Valor medio (en log 10 UFC/g)


0,33

0,19

0,29


0,17

0,17

0,24


5,25

3,99

2,26


0,48

0,47

0,39

Tabla A.3. Resultados del análisis de datos obtenidos con muestras de huevo en polvo

Muestra/Nivel de contaminación

Huevo en polvo nivel bajo

Huevo en polvo nivel medio

Huevo en polvo nivel alto


23

23

23


2

2

2


20

20

20


40

40

40


3,17

4,10

5,23


0,09

0,09

0,12


2,78

2,17

1,96


0,25

0,25

0,22


0,11

0,10

0,11


3,57

2,55

2,08


0,32

0,29

0,30

Tabla A.4. Resultados del análisis de datos obtenidos con materiales de referencia materiales de referencia Muestra/Nivel de contaminación Número de laboratorios que proporcionaron resultados

(capsula que contiene unas 5 000 UFC 23


2


20


40


3,79


0,07


1,76


0,19


0,14


3,68


0,39

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4779 (Primera actualización)

ANEXO B (Informativo) MEDIO DE CULTIVO ALTERNO B.1 PLASMA DE CONEJO Se usa plasma de conejo deshidratado comercialmente disponible y se rehidrata de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si no se dispone de plasma de conejo deshidratado, se diluye un volumen de plasma de conejo estéril fresco con tres volúmenes de agua estéril. Se adiciona la solución de EDTA (ácido etilén-diamina-tetra-acético) para dar 0,1 % de EDTA en el plasma rehidratado o diluido, si se ha usado citrato de potasio o citrato de sodio como anticoagulante. A menos que lo indique indique el fabricante, fabricante, el plasma rehidratado rehidratado o diluido debe ser usado inmediatamente. Antes de su uso, se ensaya cada lote de plasma con cepas de estafilococos estafilococos coagulasa positiva y cepas de estafilococos coagulasa-negativa.

B.2 MEDIO PLASMA DE CONEJO FIBRINÓGENO (VER REFERENCIAS [6] Y [7]) NOTA Se puede usar medio de cultivo comercialmente disponible. Sin embargo, considerando la conocida variedad de los lotes de suplemento fabricados, se recomienda que cada lote de solución de fibrinógeno bovino/plasma de conejo se pruebe antes de su uso, frente a controles positivos y negativos.

B.2.1 Medio base Preparar el medio base como se menciona en el numeral 5.3.1 con la excepción de que la distribución del medio base se hace en cantidades de 90 ml por Erlenmeyer o frasco.

B.2.2 Soluciones B.2.2.1 Solución de telurito de potasio Prepararla solución de telurito de potasio como se indica en el numeral 5.3.2.1.

B.2.2.2 Solución de fibrinógeno bovino B.2.2.2.1 Composición Fibrinógeno bovino Agua destilada destilada o desionizada desionizada

5ga7g 100 ml

Dependiendo de la pureza del fibrinógeno bovino.

B.2.2.2.2 Preparación Bajo condiciones asépticas, se disuelve el fibrinógeno bovino en el agua justo antes de su uso.

B.2.2.3 Solución de plasma de conejo e inhibidor de tripsina B.2.2.3.1 Composición Plasma de conejo con EDTA para coagulasa Inhibidor de tripsina

30 ml 30 mg

B.2.2.3.2 Preparación Operando bajo condiciones asépticas, disolver los componentes en el agua justo antes de su uso.

B.2.3 Medio completo B.2.3.1 Composición Medio base solución de telurito de potasio solución fibrinógeno bovino Solución de plasma de conejo e inhibidor de tripsina

90 ml 0,25ml 7,5 ml 2,5 ml

B.2.3.2 Preparación Fundir el medio, luego enfriarlo a 48 °C ± 1 °C en un baño de maría (véase el numeral 6.4). Se adiciona, bajo condiciones asépticas, las tres soluciones previamente calentadas en un baño de maría a 48°C ± 1°C. Se mezcla bien después de cada adición mediante rotación para minimizar La formación de espuma. Se usa el medio completo inmediatamente después de su preparación, con el fin de evitar cualquier precipitación del plasma. ADVERTENCIA ADVERTENCIA Si Si se consigue consigue comercialme comercialmente nte solución solución de plasma plasma de fibrinógeno bovino/plasma de conejo, se deben seguir con mucho cuidado las indicaciones del

fabricante para la preparación de esta solución y del medio completo (en particular la temperatura del medio base) de lo contrario, el medio puede perder completamente su actividad.

B.3 PREPARACIÓN DE LAS CAJAS Véase el numeral 5.3.4.

B.4 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN CUANDO SE EMPLEA MEDIO PLASMA DE CONEJO FIBRINÓGENO VÉASE NUMERAL B.2 B.2 B.4.1 Se transfiere por medio de una pipeta estéril (véase el numeral 6.8), 1 ml de la muestra de ensayo si es líquida, o 1 ml de la suspensión en el caso de otros productos, a cada una de las dos cajas (véase el numeral 6.6). Se toman otras dos cajas de Petri estériles y se transfiere 1 ml de la primera dilución decimal a cada una de las cajas. Se repiten estas operaciones con diluciones decimales sucesivas usando una pipeta estéril para cada dilución decimal.

B.4.2 En cada caja de Petri (véase el numeral 9.3.1), se vierte inmediatamente medio completo recién preparado (véase el numeral 5.6.3) (no guardar en forma líquida) hasta una profundidad de 3 mm aproximadamente. Se mezcla cuidadosamente el inóculo con el medio de cultivo y se deja solidificar colocando las cajas de Petri en una superficie horizontal fría.

B.4.3 Después de una completa solidificación, se invierten las cajas preparadas colocándolas en la incubadora (véase el numeral 6.2) a 35 °C± 2 °C por 18 h a 24 h. Si es necesario, se re incuba por 18h a 24 h.

B.5 SELECCIÓN DE LAS CAJAS E INTERPRETACIÓN CUANDO SE EMPLEA MEDIO PLASMA DE CONEJO FIBRINÓGENO VÉASE EL NUMERAL NUMER AL 5.6 Después de un periodo de incubación suficiente (véase el numeral 9.3.3), los estafilococos forman pequeñas pequeña s colonias negras o grises o aún blancas rodeadas de un halo de precipitación, indicando la coagulación. Las colonias de Proteus pueden mostrar, al inicio de la incubación, una apariencia similar a las colonias de estafilococos coagulasa-positiva. Sin embargo, después de 24 h a 48 h de incubación, pueden tener una apariencia de un cultivo extendido, más o menos pardo, que las permiten diferenciar de los estafilococos. Se cuentan las colonias típicas de cada placa. Debido a que el agar plasma de conejo fibrinógeno está basado en una reacción de coagulasa, no es necesario confirmar esta actividad.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4779 (Primera actualización) ______________ _____________________ _______________ _______________ _______________ ______________ _____________ ______________ _________ __

ANEXO C (Informativo)

CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS A LA NTC 4779 (Primera actualización) Y LA NTC 4491:2000 NTC 4491 (primera actualización)

NTC 4779

sustentación

0. INTRODUCCION 0.2 En general, se usa la técnica con agar Baird Parker. En casos de encontrar colonias atípicas de estafilococo o flora acompañante en el agar Bair Parker. procedentes de ciertas muestras como quesos hechos de leche cruda o ciertos productos a base de carne cruda, se recomienda utilizar alternativamente la técnica de agar fibrinógeno de plasma de conejo

0. INTRODUCCION 0.2 En general, se usa empleando la técnica con agar Baird Parker. Sin embargo, es preferible usar 51 procedimiento descrito cuando en la técnica se usa el agar plasma de conejo fibrinógeno solo para los alimentos (talos como queso, leche cruda o ciertos productos a base de carne cruda, que probablemente estén contaminados por - colonias atípicas de estafilococos de agar Baird Parker. - flora acompañante que pueda ocultar las colonias observadas.

Se modifica la introducción para explicar que en la nueva versión se incluye un anexo B (informativo) con la técnica de agar fibrinógeno de plasma de conejo que es utilizada para el diagnóstico de S. Aureus en productos productos tales como lácteos o carnes crudas.

Se incluyeron las 2. REFERENCIAS 2. REFERENCIAS referencias normativas NORMATIVAS NORMATIVAS para la preparación de las muestras para ensayo, NTC 4491-1, NTC 4491:1998, suspensiones iniciales y Microbiología de Microbiología de diluciones decimales que alimentos y de alimentos alimentos y de alimentos reemplazaron la NTC

para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales. (ISO 6887-1).

para animales. 4491, que han sido Preparación de muestras adoptadas por el comité para ensayo, técnico. suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales. (ISO/DIS 6887).

NTC 4491-2, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 2: Reglas específicas para la preparación de carne y productos cárnicos. (ISO 6887-2).

NTC 4092:1998, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Requisitos generales para el examen microbiológico. (ISO 7218)

NTC 4491-3, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 3: RegIas específicas para preparación de muestras de pescado y productos de la pesca. (ISO 68873). NTC 4491-4, Microbiología de alimentos y de alimentos

para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 4: RegIas específicas para la preparación de productos deferentes de leche, productos lácteos, carne, productos cárnicos, pescado y productos de la pesca. (ISO 6887-4). NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Requisitos generales para el examen microbiológico. (ISO 7218).

3.1 Estafilococos 3.1 ESTAFILOCOCOS coagulasa positiva. COAGULASA Bacteria esférica POSITIVA

Se modifica la definición de acuerdo con el Manual Bergey’s, para la aeróbica, gram (+), que Cocos en forma de clasificación y aparece aislada, racimos, gram (+), descripción formando parejas, catalasa (-f) en la morfológica de tétradas o agrupadas en superficie de un medio de microorganismos, racimos, inmóviles, cultivo selectivo, con una Versión 2005. capaces de coagular el reacción positiva de la plasma, convirtiendo el coagulasa cuando el fibrinógeno en fibrina ensayo es realizado siguiendo el método siguiendo el método especificado en esta especificado en esta norma. norma.

4.3 Se calcula del número de estafilococos coagulasa positiva por mililitro, o por gramo, de muestra a partir del número de colonias típicas y/o atípicas obtenidas en cajas de los

4.3 Se calcula del Se incluye la nota número de estafilococos aclaratoria respecto al coagulasa-positiva por uso de métodos alternos mililitro, o por gramo, de actualmente para la muestra a partir del determinación de S. número de colonias Aureus. típicas y/o atípicas obtenidas en cajas de los

niveles de dilución escogidos de tal forma que de un resultado significativo, y confirmado con el resultado positiva de la prueba de la coagulasa.

niveles de dilución escogidos de tal forma que de un resultado significativo, y confirmado con el resultado positiva de la prueba de la coagulasa.

NOTA La determinación de S. aureus puede realizarse también por los siguientes métodos: siembra en membranas hidrofóbicas. PCR u otro método búsqueda.

5.3.2.2 Emulsión de yema de huevo (concentración aproximada del 20 % o de acuerdo con las instrucciones del fabricante) ... Se retira asépticamente el sobrenadante. La solución debe ser en lo posible utilizada en su totalidad. Se adiciona, bajo condiciones asépticas, la yema de huevo. Se mezcla bien después de cada adición mediante rotación para minimizar la formación de espuma.

5.3.2.2 Emulsión de yema de huevo (concentración aproximada del 20 % o de acuerdo con las instrucciones del fabricante) ... Se retira asépticamente el sobrenadante. La solución debe ser almacenada + 3ºC ± 2ºC, máximo por 72 h.

Servir inmediatamente en las cajas de Petri.

5.3.4 Preparación de las cajas ...Antes del uso para eliminar la condensación,

5.3.4 Preparación de las cajas ...Antes del uso, se secan las cajas,

Se modifica el numeral respecto a normas de bioseguridad y buenas prácticas de laboratorio

se deben dejar las cajas, con las tapas sueltas en un área aséptica.

preferiblemente con las tapas sueltas y con la superficie del agar hacia abajo, en un horno a una temperatura entre 25ºC y 50ºC, hasta que las gotas se hayan dispersado en la superficie del medio 6.3 Cabina de secado o incubadora, capaz de mantener la temperatura de 25ºC ±1ºC.

9.1 Porción de ensayo, suspensión inicial y diluciones.

9.1 Porción de ensayo, suspensión inicial y diluciones.

Véase la NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 44913, NTC 4491-4 y la norma específica para el producto en cuestión

Véase la NTC 4491 y la norma específica para el producto en cuestión.

9.4.1 Cuando se emplea Medio Baird Parker Véase el numeral 5.3.3

9.4.1 Cuando se emplea Medio Baird Parker Véase el numeral 5.3.3

…Véase el numeral en la norma NTC 4779 (primera actualización)

11. PRESICION Véase el numeral en la norma NTC 4779 (primera actualización)

11. PRESICION

en los laboratorios de microbiología dictados en curso por entes regulatorios, buscando evitar la contaminación de los medios de cultivo, utilizadas para las determinaciones. Se elimina este equipo debido a que el secado de los medios de cultivo se realiza en un área o cabina aséptica y no en una estufa de secado. Se incluyen las referencias de las normas técnicas que reemplazaron la ISO 4491.

Se modifica el numeral de acuerdo con la actualización realizada en el documento de referencia, respecto con el numero colonias típicas o colonias atípicas o ambas que deben ser tenidas en cuenta para realizar la confirmación. Adicionalmente Adicionalmente en las las notas se aclara que las colonias que deben ser tenidas en cuenta para esta determinación se aclara en la nota 1. Se incluye la información para determinar la precisión de la prueba, que se encuentra en la

ANEXO A (informativo) RESULTADO DE ESTUDIO INTERLABORATORIOS ANEXO B (informativo) MEDIO DE CULTIVO ALTERNO B.1 PLASMA DE CONEJO

5.6 MEDIO DE PLASMA DE CONEJO FIBRINOGENO 9.3 INOCULACION E INCUBACION CUANDO SE EMPLEA MEDIO PLASMA DE CONEJO FIBRINOGENO

actualización del documento de referencia. Se incluyen los resultados de los estudios interlaboratorio realizados por el grupo de trabajo de la ISO para estandarizar la técnica analítica. Se envía la preparación y la técnica del medio del plasma de conejo con un medio alternativo para la determinación de S. aureus en productos como cárnicos crudos y lácteos y no como parte de la prueba de rutina para la su determinación.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4779 (Primera actualización) ______________ _____________________ _______________ _______________ _______________ ______________ _____________ ______________ _________ __

BIBLIOGRAFIA

[1] NTC 5014, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Protocolo para la validación de métodos alternos. [2] ISO 5725-2 - Accuracy (Trueness and Precision) 01 Measurement Methods and Results. Part 2: Basic Method for the Determination Repeatability and Reproducibility of Standard Measurement Method. [3] ISO 16140 - Microbiology of Food and Animal Feeding stuffs. Protocol for the Validation of Alternative Methods. [4] DE BUYSER, M.L., LOMBARD, B., SHULTEN, S.M., lN’r VELO, P.R., SCOTTER, S.L., ROLLIER, R., LAHELLEC, C. Validation of EN ISO Standard Methods 6888 Part I and Part 2:1999, Enumeration of Coagulase-Positive Staphylococci Staphylococci in Foods. Int. Food Microbiol…83(2), 2003, pp. 185 -194. [5] AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 18th Ed 2005, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 975.55.S aureus in dairy foods. p 87-89. Chapter 17. [6] BECKERS H.L. et al. Evaluation of a Pour-Plate System with Rabbit PlasmaBovine Fibrino gen Agar for the Enumeration of Staphylococcus Aureus in Food. Can. J. Microbio!., 30, 1984, pp 470-474. [7] SAWNEY D. The Toxicity of Potassium Tellurite to Staphylococcus Aureus in Rabbit Plasma Fibrinogen Agar, J. Applied Bacteriology. 61, 1986, pp. 149-155.

NTC 4779

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