Practica Distribucion Intracelular de Las Enzimas de Oxido Reduccion (1)

PRACTICA N° 4: DEMOSTRACION DE LA DISTRIBUCION INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE OXIDO- REDUCCION SISTEMA I: Usando 2,6-diclorofenolindofenol

I. 

PROCEDIMIENTO: 

Colocar en cada no de lo! " #$o! de en!a%o& lo! re!'ec#()o! reac#()o!& de acerdo al !(*(en#e cadro: COMPONENTES +,l B//er /o!/a#o 0.1M& '2 3.4 -5 d(cloro/enol(ndo/enol Scc(na#o de Sod(o 6racc(7n nclear 6racc(7n ,(#ocondr(al 6racc(7n ,(cro!o,al-!ol$le 2o,o*en(8ado #o#al

 

II. 

I 1.0 1.0 0. -

II 0." 1.0 0. 0." -

III 0." 1.0 0. 0." -

I 0 ." 1 .0 0 . 0 ." -

 0." 1.0 0. 0."

Le*o de /or,ado el !(!#e,a& !e ,e8cla % !e de9a en re'o!o a #e,'era#ra a,$(en#e. O$!e O$ !er)a r)arr con!# con!#an an#e #e,e ,en# n#ee % ano# ano#ar ar lo! lo! ca,$( ca,$(o! o! de colo color& r& 'ara 'ara (n#e (n#er' r're# re#ar ar lo! lo! re!l#ado!.

OBSERACIONES: TUBO N° I: En e!#e #$o de en!a% !a%o& !e ence cen#r n#ra la !!# !!#aanc(a $//er& el (nd(cador +-5 -5 d(cloro/enol d(cloro/enol(ndo/en (ndo/enol ol % el !!#ra#o +!cc(na#o +!cc(na#o de !od(o al no encon#rar!e encon#rar!e el co,'le9o co,'le9o en8(,;#(co& no !e 'rodce reacc(7n& %a <e no !e 'ede /or,ar el co,'le9o E-S E-S % 'or #an#o& #a,'oco e=(!#e /or,ac(7n del 'rodc#o e!#o !e e)(denc(a en <e en el #$o de en!a%o a'arece n color a8l o!cro. TUBO N° II: En e!#e #$o de en!a% !a%o& !e ence cen#r n#ra la !!# !!#aanc(a $//er& el (nd(cador +-5 -5 d(cloro/enol d(cloro/enol(ndo/en (ndo/enol& ol& el !!#ra#o +!cc(na#o +!cc(na#o de !od(o % la /racc(7n nclear. nclear. O$!er)a,o! O$!er)a,o! <e a'arece n color a8l o!cro& con lo <e 'ode,o! dedc(r <e en la /racc(7n nclear no e=(!#en en8(,a! <e !e nan al !!#ra#o % /or,en el co,'le9o E-S & 'or lo <e no !e 'rodce la reacc(7n

TUBO N° III: En e!#e #$o encon#ra,o! la !!#anc(a $//er& el (nd(cador +-5 d(cloro/enol(ndo/enol& el !!#ra#o +!cc(na#o de !od(o % la /racc(7n ,(#ocondr(al +co,'le9o en8(,;#(co. O$!er)a,o! <e el color a8l o!cro !e decolora& lo <e e! (nd(cador de <e e=(!#e na redcc(7n % 'or  #an#o !e >a 'rodc(do la reacc(7n. De e!#o dedc(,o! <e en la /racc(7n ,(#ocondr(al !?  'ode,o! encon#rar en8(,a! <e !e nan al !!#ra#o& /or,en el co,'le9o E-S % 'or #an#o& /or,en el 'rodc#o. TUBO N° I: En e!#e #$o encon#ra,o! la !!#anc(a $//er& el (nd(cador +-5 d(cloro/enol(ndo/enol& el !!#ra#o +!cc(na#o de !od(o % la /racc(7n ,(cro!o,al +or*anela! 'e<e@a! #ale! co,o: r($o!o,a!& REL& RER . O$!er)a,o! <e el color <e a'arece e! a8l o!cro& lo <e (nd(ca <e no !e >a 'rodc(do la reacc(7n& e! dec(r& <e en la! or*anela! 're!en#e! en la /racc(7n ,(cro!o,al& no !e encen#ran en8(,a! 'ara 'oder /or,ar el co,'le9o E-S % 'o!#er(or,en#e el 'rodc#o. TUBO N° : En e!#e #$o encon#ra,o! la !!#anc(a $//er& el (nd(cador +-5 d(cloro/enol(ndo/enol& el !!#ra#o +!cc(na#o de !od(o % el >o,o*en(8ado #o#al +donde !e encen#ran #oda! la! /racc(one! %a ,enc(onada!. Se o$!er)a n ca,$(o de color& %a <e el a8l !e decolora lo <e no! (nd(ca <e !e >a 'rodc(do na redcc(7n % 'or #an#o& na reacc(7n. E!#o <(ere dec(r <e en el >o,o*en(8ado #o#al !? e=(!#en en8(,a! 'ara 'oder /or,ar el 'rodc#o.

SISTEMA II: Usando p-fenilendiamina. I. 

PROCEDIMIENTO:



Colocar en cada no de lo! " #$o! de en!a%o& lo! re!'ec#()o! reac#()o!& de acerdo al !(*(en#e cadro: COMPONENTES +,l B//er /o!/a#o 0.1M& '2 3.4 P-/en(lend(a,(na 1 6racc(7n nclear 6racc(7n ,(#ocondr(al 6racc(7n ,(cro!o,al-!ol$le 2o,o*en(8ado #o#al

 

II. 

I 1." 0." -

II 1.0 0." 0." -

III 1.0 0." 0." -

I 1.0 0." 0." -

 1.0 0." 0."

Le*o de /or,ado el !(!#e,a& !e ,e8cla % !e de9a en re'o!o a #e,'era#ra a,$(en#e. O$!er)ar con!#an#e,en#e % ano#ar lo! ca,$(o! de color& 'ara (n#er're#ar lo! re!l#ado!.

OBSERACIONES: TUBO N° I: En e!#e #$o de en!a%o encon#ra,o! !!#anc(a $//er % la '-/en(lend(a,(na <e ac#ar; co,o (nd(cador % !!#ra#o. O$!er)a,o! <e !e #orna n color ,arr7n claro& 'or lo #an#o e!#e color e)(denc(ara <e no !e >a 'rodc(do reacc(7n& %a <e en e!#e #$o de en!a%o no e=(!#e n(n*n co,'le9o en8(,;#(co 'ara 'oder /or,ar el 'rodc#o. TUBO N° II: En e!#e #$o de en!a%o encon#ra,o! !!#anc(a $//er& la '-/en(lend(a,(na +(nd(cador % !!#ra#o % la /racc(7n nclear. O$!er)a,o! <e el color <e a'arece en e!#e #$o de en!a%o e! el color ,arr7n claro % co,'ar;ndolo con el #$o n°1 no! da,o! cen#a <e e!#e color e! (nd(cador de <e no !e >a 'rodc(do reacc(7n 'or lo #an#o dedc(,o! <e en la /racc(7n nclear no e=(!#en en8(,a! 'ara 'oder lle)ar a ca$o la reacc(7n de 7=(do-redcc(7n % 'or  #an#o /or,ar el 'rodc#o.

TUBO N° III En e!#e #$o de en!a%o encon#ra,o! !!#anc(a $//er & la '-/en(lend(a,(na +(nd(cador % !!#ra#o % la /racc(7n ,(#ocondr(al +co,'le9o en8(,;#(co. O$!er)a,o! <e a'arece n color ,arr7n o!cro& lo <e (nd(ca <e !? !e 'rodce /or,ac(7n de 'rodc#o % 'or #an#o& !?

>a% reacc(7n. E!#o de$(do a <e en la /racc(7n ,(#ocondr(al !? e=(!#en en8(,a! 'ara 'oder  /or,ar el 'rodc#o % lle)ar a ca$o la reacc(7n. TUBO N° I: En e!#e #$o de en!a%o encon#ra,o! !!#anc(a $//er& la '-/en(lend(a,(na +(nd(cador % !!#ra#o % la /racc(7n ,(cro!o,al. O$!er)a,o! <e e=(!#e n color ,arr7n claro& <e (nd(ca <e no !e >a /or,ado el 'rodc#o % 'or #an#o no !e >a 'rodc(do la reacc(7n. E!#o de$(do <e en la /racc(7n ,(cro!o,al +or*anela! 'e<e@a!: REL& RER % r($o!o,a! no e=(!#en en8(,a! ca'ace! de ca#al(8ar reacc(one! de 7=(do-redcc(7n. TUBO N° : En e!#e #$o de en!a%o encon#ra,o! !!#anc(a $//er & la '-/en(lend(a,(na +(nd(cador % !!#ra#o % el >o,o*en(8ado #o#al. O$!er)a,o! <e en e!#e #$o el color !e #orna ,arron o!cro % e!#o de$(do a <e !( !e 'rodce la reacc(7n& %a <e en el >o,o*en(8ado& e=(!#e #a,$(n /racc(7n ,(#ocondr(al donde !e encen#ran la! en8(,a!.

CONCLUSION: 

La! en8(,a! de 7=(do-redcc(7n !e encen#ran d(!#r($(da! en la ,(#ocondr(a % en el e='er(,en#o& #a,$(n !e encen#ran en el >o,o*en(8ado #o#al& e!#o de$(do a <e en d(c>o >o,o*en(8ado #a,$(n !e encen#ra la /racc(7n ,(#ocondr(al.

CUESTIONAIO:

!.

 e! el &5 d(cloro/enol(ndo/enol % c7,o ac#a en la cadena re!'(ra#or(aF El &5 d(cloro/enol(ndo/enol e! na !!#anc(a (nd(cadora <e e! a8l en ! /or,a o=(dada % !e decolora cando !e redce. G!#e ac#a en#re la 6MN % la Co A!?& !( n (n>($(dor (,'(de <e el &5 d(cloro/enol(ndo/enol !e red8ca& <(ere dec(r <e d(c>o (n>($(dor e!#a ac#ando en al*na re*(7n an#er(or a la 6MN& 'ero !( el (nd(cador !e redce& <(ere dec(r <e el !(#(o de (n>($(c(7n e!#a en al*n l*ar 'o!#er(or a la Co&(ncl!()e.

2.

 e! el '-/en(lend(a,(na % co,o ac#a en la cadena re!'(ra#or(aF La '-/en(lend(a,(na e! na !!#anc(a (nd(cadora <e #a,$(n 'ede ac#ar co,o !!#ra#o. Cando !e o=(da& e! dec(r cede elec#rone!& ca,$(a de color a ,arr7n o!cro de lo con#rar(o& ,an#endr; n color   ,arr7n ,% claro. De e!#a ,anera !e 'ede )er(/(car !( la cadena co,'rend(da en#re el c(#ocro,o C % el O  e! o no  'er,ea$le al /l9o de elec#rone! 'ro)en(en#e del (nd(cador. S( !e a'l(ca n (n>($(dor en al*n 'n#o de e!#a 'orc(7n de la cadena& la '-/en(lend(a,(na no !e o=(dara& 'ero !( el (n>($(dor no (,'(de ! redcc(7n <(ere dec(r <e e!#a ac#ando en al*n !(#(o an#er(or al c(#ocro,o C o de la cadena.

".

Hra/(<e& !#ed en na cadena de 7=(do-redcc(7n $(ol7*(ca a la acc(7n de lo! (nd(cadore! redo= &5 d(cloro/enol(ndo/enol % '-/en(lend(a,(na.

SUCCINAT

FAD Fe-S

NADH

FMN,

Q

Cit b, Fe-S,

Cit

Hem a hem

O2

&5 d(cloro/enol(ndo/enol

ADP +

#.

ATP

ADP +

 '-/en(lend(a,(na

ATP

ADP +

ATP

 e! n >o,o*en(8ado de >?*ado % co,o !e o$#(enen la! /racc(one! cellare! 'or cen#r(/*ac(7n d(/erenc(alF E! n 're'arado <e con#(ene /racc(one! ,(#ocondr(al& ,(cro!o,al % nclear. Se 're'ara ,ed(an#e lo! !(*(en#e! 'a!o! +T°  0 °C J 4 °C: Colocar el >?*ado en 'e#r( % el(,(nar ! ca'!la % o#ro! #e9(do! 'er(/r(co!. Pe!ar 10 * de >?*ado % cor#ar en /ra*,en#o! 'e<e@o!. Colocar en n >o,o*en(8ador 'o##er % a*re*ar !olc(7n de KClO 1"4M. 2acer 're!(7n ,anal con el e,$olo *(rando >ac(a el /ondo. El >o,o*en(8ado e! cen#r(/*ado a 00 re)olc(one! 'or 10 ,(n#o! coloc;ndolo en #$o! de 'ol(e#(leno& 're)(a cal($rac(7n en la $alan8a& !e e,'lea na cen#r(/*a re/r(*erada. El !o$renadan#e! !e'arado 'or n $eaer de "00 ,l El !ed(,en#o con!#(#%e la /racc(7n nclear % !e coloca en n $eaer de 100 ,l. El !o$renadan#e an#er(or e! cen#r(/*ado a 1"00 re)olc(one! 'or 1" ,(n#o! en la cen#r(/*a re#(rada. Se !e'ara el !o$renadan#e en n $eaer& con!#(#%endo la /racc(7n ,(cro!o,al con el c(#o!ol. El !ed(,en#o !e !e'ara en o#ro $eaer % con!#(#%e la /racc(7n ,(#ocondr(al. • • • • •

• • •

•

•

". En < /racc(one! cellare! !e encen#ran la! en8(,a! de 7=(do-redcc(7nF • •

6.

6racc(7n ,(#ocondr(al 2o,o*en(8ado #o#al

2a*a n e!<e,a de la cen#r(/*ac(7n d(/erenc(al.