RE ACCI N DE TR TRANSA SAM MIN INA AC I N Y SU SU RECONOCIMIENTO POR MEDIO DE CROMATOGRAFIA EN PAPEL
INTRODUCCION
5µL 1000 µ
La reacción de transaminación implica el paso reversible de un grupo alfa amino de un aminoácido, al carbono alfa de un alfa-ceto ácido. Las enzimas que catalizan esta reacción se denominan aminotransferasas o transaminasas y utilizan al fosfato de piridoxal como cofactor. Son enzimas ampliamente distribuidas en numerosos tejidos y se localizan en la mitocondria y en el citosol. La función de las transaminasas es la de recoger los grupos alfa amino de la mayoría de los aminoácidos en un solo aminoácido, el ácido glutámico, por lo que la mayoría de estas enzimas utilizan al alfa-cetoglutarato como aceptor de los grupos amino. Algunas de las transaminasas más importantes, son: la alanina transaminasa-glutámico-pirúvica (TGP) y la aspártico transaminasa-glutámico-oxalacetica (TGO). La determinación de la actividad de estas transaminasas en el suero sanguíneo constituye un procedimiento de diagnóstico importante en medicina, utilizado para determinar la gravedad de los ataques cardiacos y vigilar la recuperación del paciente, así como para poner de manifiesto los efectos tóxicos de algunos productos químicos
OBJETIVOS Cuantificar la actividad de la transaminasa ALAT/TGP presente en un extracto crudo de hígado empleando, un método cromatográfico y otro espectrofotométrico.
10 µL 10µL 1000 µ
20 20 = . . á á
15 µL 15µL 1000 µ
20 20 = . . á á
20 µL 20µL 1000 µ
20 20 = . . á á
25 µL 25µL 1000 µ
20 20 = . . á á
µL A. Glutámico 5 10 15 20 25 Testigo Problema
RESULTADOS µL A. Glutámico 5 10 15 20 25 Testigo Problema
20 20 = . . á á
Absorbancia
µmoles
-0.003 0.025 0.071 0.103 0.180 -0.006 0.193
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.11 0.56
0.2
Sustancia
Solvente
Rf
29.2 28.8 28.7 29.2 29.2 ----21.9
49.5 49.5 49.5 49.5 49.5 49.5 49.5
0.589 0.581 0.579 0.589 0.589 -----0.442
y = 0.444x 0.444x - 0.058
0.15 A I C N A B R O S B A
0.1
0.05
0
Calculo µmoles de ácido glutámico 5 µL
0 -0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
ΜMOLES A. GLÚTAMICO
Gráfica 1: Absorbancia Absorbancia vs µmoles de ácido glutámico glutámico
1
Calculo de los µmoles reales µmoles reales = µmoles P - µmoles T µmoles reales = 0.56 – 0.11 = 0.45 µmoles
Calculo de UAT UAT =
UAT =
decir que se obtuvo ácido glutámico, en cambio la mancha de nuestro testigo no se encontraba a una distancia cercana a la del ácido glutámico, y esto es correcto ya que cuando preparamos los tubos, al testigo no se le adiciono ácido alfa-cetogluratico y por lo tanto la reacción no nos daría ácido glutámico. También se observan otras manchas de nuestro problema y testigo a la misma distancia que la mancha de la solución de alanina.
[ á] ℎí ℎ [ .4 ]
= 10
(.4 ) ( ℎ)
DISCUSIONES Al inicio del experimento, se prepararon 2 tubos, los cuales serían el testigo y el problema, a ambos se les adiciono 1 mL de preparación de transaminasa, 1 mL de regulador de fosfatos, 0.5 mL de alanina, se preincubaron los tubos a 37°C por 5 minutos. Posteriormente se le adiciono al tubo testigo 0.5 mL de agua y al tubo problema se le adiciono 0.5 mL de ácido alfa-cetogluratico, al tubo testigo no se le adiciono este reactivo, por lo tanto se espera observar la reacción de transaminación en el tubo problema y en el tubo testigo no. Después se incubaron los tubos a 37°C durante 1 hora con agitación, al finalizar la incubación se adiciono a ambos tubos 4 mL de alcohol 96°, al adicionar este reactivo se detiene la reacción, ya que cambiamos la constante dieléctrica y la enzima precipitar. Por último se centrifugaron los tubos 10 minutos a 2500 rpm, los sobrenadantes se transfirieron a vasos de precipitados y se calentaron casi a sequedad, posteriormente las muestras se disolvieron con 1mL de agua destilada. Posteriormente se realizó la cromatografía en papel, se colocaron en el cromatograma 8 puntos equidistantes, en los primeros 5 puntos se colocaron 5, 10, 15, 20 y 25 µL respectivamente de una solución de ácido glutámico (con estos posteriormente se construyó la curva tipo), en los puntos 6 y 7 se colocó 60 µL de la solución testigo y problema respectivamente, por ultimo al punto 8 se le coloco 5 µL de solución de alanina. Más tarde el cromatograma se saturo durante 2 horas con el disolvente etanol:metanol:agua:urea, se dejó desarrollar cromatograma durante 18 horas aproximadamente. Al sacar el cromatograma se calentó en la estufa a 70°C hasta evaporar el disolvente. Posteriormente se revelo el cromatograma por aspersión de una solución de ninhidrina en etanol. Se observaron en el cromatograma la formación de manchas color morado que se encontraban a una distancia muy similar en el cromatograma, estas manchas corresponden al acido glutámico, y observamos que nuestra mancha problema si se encontraba a la una distancia muy similar a la de las aplicación del ácido glutámico, por lo tanto podemos
Posteriormente, se recortaron las manchas correspondientes a ácido glutámico en el cromatograma, se colocaron en tubos se ensaye y se les adiciono 1 mL de butanol al 1%, se calentaron los tubos a 80°C por dos minutos, se enfriaron en un baño de hielo y se les agrego 5 mL de acetona, por último se leyeron en el espectrofotómetro los tubos, y se construyó la curva tipo con las absorbancias los tubos de 5, 10, 15, 20 y 25 µL y con sus posteriores µmoles. Se obtuvieron con ayuda de la gráfica los µmoles de ácido glutámico para el problema, que fue de 0.56 µmoles.
CONCLUSIONES
Se obtuvo acido glutámico a partir de la reacción de transaminación entre la alanina y el α cetoglutarato. Se pudo observar la reacción de transaminación debido a la obtención de transaminasa.
BIBLIOGRAFÍA 1.
2.
E. Conn Eric, “ Bioquímica fundamental”, Universidad de California, Editorial Limusa, 2001, México D.F. Voet Donald, “Fundamentos de Bioquímica”, Editorial Médica Panamericana, 2ª Edición, 2007, Madrid, España.
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