CÁTEDRA DE MICOLOGÍA Facultad de Bioquímica y Ciencias Biol!icas "ni#e$sidad %acional del Lito$al TOMA DE M"E&TRA DE MICO&I& &"'ERFICIALE& ()*+,OBJETIVOS - Conocer las instrucciones que deberá recibir el paciente para permitirnos realizar realizar una buena toma de muestra. - Cono Conoce cerr las las dist distin inta tass forma formass de toma tomarr una mues muestr tra a de mico micosi siss supe superf rfic icia iall dependiendo de la lesin ! la cl"nica del paciente. - Conocer los distintos m#todos para el procesamiento de la muestra. - Cono Conocer cer las las dife diferen rente tess cond condic icion iones es de cult culti$ i$o o a util utiliz izar ar se%& se%&n n la sospe sospec' c'a a dia%nstica ! lo obser$ado al microscopio. I(T)O*+CCI,(
El dia%nstico dia%nstico de una micosis se 'ace fundamentalme fundamentalmente nte por la demostracin demostracin del 'on%o en las muestras biol%icas ! su posterior identificacin taonmica mediante el estudio de sus caracter"sticas morfol%icas ! fisiol%icas. El dia%nstico de una micosis superficial se realiza en / etapas0 12reparacin pre$ia del paciente ! anamnesis. 3Toma oma de muestra0 a - antisepsia pre$ia del paciente b - obtencin del material biol%ico c - recoleccin del material /- 2rocesamiento de la muestra0 a- m#todos directos b- m#todos indirectos
+. 'RE'ARACI/% 'RE0IA DEL 'ACIE%T 'ACIE%TE E El dia%nstico de una micosis depende en %ran parte de una correcta toma de muestra por lo que 'a! que poner especial atencin en su obtencin. 2ara ello se debe entre%ar en forma escrita las si%uientes indicaciones al paciente0
Indicaciones generales
Justificación
a- (o aplicarse en forma tpica o local 5a aplicacin tpica de medicamentos medicamentos antif&n%icos por lo menos 4 antif&n%icos impide la recuperacin de 'on%os d"as antes de la toma de muestra. en los culti$os. b- 6i%ienizarse la zona antes de concurrir al laboratorio con 7abn blanco o solucin salina 8si está contraindicado el 7abn9 la$ando la lesin con una %asa ! no con al%odn.
5a 'i%iene pre$ia disminu!e las posibilidades de contaminacin del culti$o con 'on%os filamentosos ambientales. Se prefiere el uso de %asa porque cuando se utiliza al%odn pueden quedar fibras del mismo que pueden interferir en la obser$acin microscpica.
c(o colocarse cosm#ticos talcos 5os cosm#ticos talcos etc. dificultan la perfumes etc. en la zona de la lesin. $isualizacin de las estructuras parasitarias al directo !a que suelen ser oleosos ! tener cristales. Indicaciones especiales para lesiones en uñas
Justificación
a(o cortarse al ras las u:as 2ara obtener suficiente material ! obser$ar las infectadas. caracter"sticas de la lesin b- Cepillarse las u:as infectadas lue%o de Esta operacin elimina detritos celulares ! realizar ba:os de inmersin en salmuera c#lulas muertas que interfieren en la realizacin tibia de /; minutos repitiendo los / d"as del directo. pre$ios a la toma de muestra / $eces por d"a. Indicaciones especiales para lesiones en piel o uñas de pies
a-
(o concurrir con sandalias.
Justificación
2ara e$itar que se produzca contaminacin de la lesin con conidias ! esporas de 'on%os filamentosos ambientales
b5ue%o de realizar la 'i%iene de la 2ara e$itar contaminaciones. zona infectada cubrir perfectamente el pie con medias ! calzado cerrado
). TOMA DE M"E&TRA a -<(TISE2SI< 2)EVI< *E5 2
para remo$er contaminantes tales como bacterias ! 'on%os filamentosos ambientales. Si se sospec'a candidiasis utilizar solucin fisiol%ica est#ril.
b - OBTE(CI,( *E5 ?
Se debe seleccionar para el raspado la zona perif#rica de la lesin donde se aprecia un borde eritematoso que indica el crecimiento acti$o del 'on%o manifestacin cl"nica producida por los dermatofitos 8tinea9. Si la lesin es 'omo%#nea podemos raspar de cualquier zona de la manc'a este tipo de lesin es caracter"stica de 2itiriasis $ersicolor. Lesiones "húmedas" o exudativas
Se deben tomar con un 'isopo 'umedecido en solucin fisiol%ica isotnica est#ril. Si no se procesa inmediatamente la muestra el 'isopo se coloca en un tubo de ensa!o est#ril para transportarse rápidamente al laboratorio. 5ESIO(ES *E C+E)O C
+A
Onicomicosis subun%ueal distal 8OS*9 Como los dermatofitos en los pacientes con OS* in$aden a las u:as por el lec'o un%ueal la muestra debe tomarse en esa zona !a que all" se encuentra una ma!or concentracin de 'on%os $iables. El material debe obtenerse con una cureta o bistur" n14 est#riles. Onicomicosis Subun%ueal 2roimal El 'on%o in$ade la u:a desde la cut"cula ! se instala en el lec'o un%ueal por esto se debe tomar la muestra por deba7o de la u:a propiamente dic'a con una cureta o bistur" n14 est#riles ! lo más cercano posible a la l&nula. Onicomicosis Blanca Superficial
El 'on%o infecta la u:a en forma superficial por ende la toma de muestra se realiza raspando la zona blanca afectada utilizando una cureta o bistur" n14 o de tama:o ma!or est#riles. Onicomicosis lateral o Candidiásica El material debe ser tomado de los bordes laterales ! proimales buscando obtener las escamas del lec'o un%ueal. En caso de ser escaso el material se puede tomar por deba7o de la u:a. En ambos casos se debe utilizar para la toma de muestra una cureta o bistur" n14 est#riles. Este tipo de infecciones suelen presentar perioniis 8inflamacin de la zona periun%ueal9 donde normalmente se puede obtener por presin material de supuracin. Este <imo debe reco%erse con 'isopo est#ril ! se lo introduce en un tubo est#ril con un peque:o $olumen de solucin fisiol%ica est#ril para mantener la 'umedad de la muestra para su posterior identificacin.
c . RECOLECCI/% DEL MATERIAL El material obtenido si%uiendo las t#cnicas descritas anteriormente 8pelos !o escamas de piel ! u:as9 se puede reco%er sobre una placa de 2etri est#ril o sobre un portaob7eto limpio flameado ! enfriado colocado de canto por deba7o de la superficie que se raspa se lo cubre con otro porta est#ril ! se los en$uel$e en una 'o7a de papel en la cual se 'a anotado la 'istoria cl"nica o el dia%nstico presunti$o de la lesin nombre edad seo ! otros datos &tiles del paciente.
,.'ROCE&AMIE%TO DE LA M"E&TRA 2ara determinar la etiolo%"a mictica de una lesin de piel ! faneras se deben realizar0 D ?#todos directos0 -Eámen directo -Coloraciones D
?#todos indirectos0 - Culti$os
a. M1TODO& DIRECTO& Es importante tener en cuenta las limitaciones de la microscop"a directa en el dia%nstico de las micosis superficiales !a que0 D 6a! un 4 a un 14> de falsos ne%ati$os en muestras de u:as. D El tiempo dedicado a la obser$acin ! la eperiencia del obser$ador influ!e en los resultados obtenidos.
D Esta t#cnica no permite realizar un dia%nstico diferencial entre los pat%enos !a que en la ma!or"a de los casos es necesario obtener un culti$o puro para identificar el pat%eno. Escamas de piel ! u:as. D Colocar una %ota de O6 al 3; > en el centro de un portaob7eto. 5a %ota debe ser peque:a porque al calentar pueden producirse pro!ecciones del O6 sobre el cubreob7etos que al enfriarse forma cristales que interfieren en la $isualizacin. D <%re%ar las escamas sobre la %ota ! por encima un cubreob7eto. D Flamear el portaob7eto 'asta el desprendimiento de burbu7as. Este procedimiento sir$e para aclarar la queratina. Si se sospec'a de 2itiriasis Versicolor se recomienda además te:ir los preparados con
Obser$ar con ob7eti$o de 1;G ! lue%o de H;G buscando0
a9 Filamentos que pueden estar o no artrosporados. Sospec'a dia%nstica0 dermatofitosis. 2osibles a%entes causales0 *ermatofitos ! raramente otros 'on%os filamentosos9. b9 Est$uctu$as le#adu$i2o$mes. Sospec'a dia%nstica0 candidiasis. 2osibles a%entes causales0 Candida spp. c9 Filamentos co$tos y acumulo de le#adu$as de / a um de diámetro. Sospec'a dia%nstica0 2itiriasis $ersicolor. 2osibles a%entes causales0 Malassezia spp. Obser$ar con ob7eti$o de 1;;G buscando0 d9 Filamentos la$!os3 2le4uosos u ondulados de *35 a *36 um de di7met$o3 de lon!itud #a$ia8le 9$esentando3 al!unos con $ami2icaciones. Son @ram ! Kcido resistentes 8in!oun 9. Sospec'a dia%nstica0 Eritrasma. en lesiones de in%le aila espacios interdi%itales ! surcos submamarios. <%entes causales0 Nocardia spp o Cor!neacterium spp Sospec'a dia%nstica0 Lueratlisis punctata. En lesiones de planta de pie. <%entes causales0 Cor!neacterium spp. #ermatophilus congolensis o $!tococcus sedentarius.
2elos0 D Cortar los pelos parasitados en fra%mentos de unos 4 mm aproimadamente. D ?ontarlos entre portaob7etos ! cubreob7etos con O6 al 3; >. 2ara pelos mu! atacados podemos $isualizar me7or las estructuras con una %ota de @ue%u#n o 5actofenol. En caso de sospec'ar Tricomicosis se debe reco%er el material di%erido por el 6idrido con a%ua destilada lue%o se centrifu%a ! se efect&a la coloracin del sedimento por los m#todos de @ram in!oun ! @iemsa. D Calentar sua$emente 'asta el desprendimiento de burbu7as. Obser$ar al microscopio en ob7eti$os de1;G ! H;G. Buscando0 a9 Conidios y:o ;i2as en el inte$io$ del 9elo . Se denomina 9a$asitacin endot$i4 cuando se encuentran conidios in$adiendo el corte ! la m#dula del pelo. Este tipo de parasitacin se presenta cuando el a%ente causal es %richoph!ton rurum % tonsurans ! otras especies más raras del %#nero %richoph!ton . Cuando en el interior del pelo se obser$an 'ifas lar%as se denomina in#asin 27#ica que es causada eclusi$amente por % schoenlenii . Sospec'a dia%nstica0 *ermatofitosis <%entes causales0 Especies del %#nero %richoph!ton . b9 Conidios en el e4te$io$ del 9elo3 !ene$almente dis9uestos en cadenas . Este tipo de parasitacin se denomina 9a$asitacin ectot$i4 que es causada por Microsporum canis M g!pseum % mentagroph!tes % ruum ! otras especies raras de Microsporum ! %richoph!ton . Sospec'a dia%nstica0 *ermatofitosis <%entes causales0 Especies del %#nero %richoph!ton o Microsporum. c9 Micelio 2ilamentoso li!e$amente 9a$du de di7met$o3 casi totalmente se!mentado acom9a?ados de ascos elí9ticos de )@ a ,@ um> en su di7met$o mayo$ conteniendo 6 ascos9o$os 2usi2o$mes con un 2ilamento te$minal en cada 9olo> Sospec'a dia%nstica0 2iedra ne%ra. <%ente causal0 &iedraia hortai . d9 Micelio 2ilamentoso con a$t$oconidios de 3 a H um de diámetro medio cu!o desarrollo 'a tenido lu%ar entre la epiderm"cula ! el tallo del pelo. Sospec'a dia%nstica0 2iedra blanca. <%ente causal0 %richosporon spp. Obser$ar al microscopio en ob7eti$os de1;;G. Buscando0 e9 Filamentos la$!os3 2le4uosos u ondulados de *35 a *36 um de di7met$o3 de
lon!itud #a$ia8le 9$esentando3 al!unos3 $ami2icaciones. Son @ram ! Kcido resistentes 8in!oun 9. Sospec'a dia%nstica0 Tricomicosis. ?ás com&n en $ello de ailas p&bico o inter%luteos. <%ente causal0 Cor!neacterium flavescens. 8 . M1TODO& I%DIRECTO& C"LTI0O Se debe realizar se%&n lo obser$ado en el análisis microscpico !o se%&n la sospec'a cl"nica. %'cnica de siemra
5a muestra debe inocularse en el medio adecuado realizando tres toques separados en la superficie del medio de culti$o seleccionado. Tomando material antes de realizar cada uno de los toques. Esto se realiza para lo%rar una ma!or sensibilidad de la t#cnica !a que se multiplica por tres la posibilidad de recuperar un 'on%o pat%eno por cada tubo sembrado. Condiciones de cultivo según el agente patógeno
Sospec'a Obser$acin *ermatofitia
?edios de culti$o a utilizar D SabouraudM D 5actrimelM Borrelli9 D *.T.?.M
Tiempo de incubacin
Temperatura de incubacin
14 - 3; d"as
34 - 3 C
6asta = d"as
34 - 3 C
8<%ar
5e$aduras
D SabouraudM
Malassezia spp.
D <%ar *ionM 6asta 14 d"as D <%ar Sab.
2iedra ne%ra
D
SabouraudM
6asta 14 d"as
34 - 3 C
2iedra blanca
D
SabouraudM
6asta 14 d"as
34 - 3 C
/3 C 8ideal9 a 3C tambi#n desarrolla
EritrasmaD <%ar san%re 4> 6asta = d"as /4 C Tricomicosis MSe puede adicionar cloranfenicol 84; - 1;; u%ml9 para e$itar la contaminacin
bacteriana.
=.ACTI0IDADE& a - Toma de muestra0 Se realizará toma de muestra de micosis superficiales entre los alumnos por lo que cada uno realizará la preparacin pre$ia de la zona en donde eiste la sospec'a de una infeccin f&n%ica o de al%&n a%ente causal de las pseudomicosis. b- 2rocesamiento de las muestras 5as muestras obtenidas durante el traba7o práctico se procesarán como fue eplicado anteriormente 8*irectos Frescos ! coloraciones9.
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P)IC6I(I-2E)EI)< VB C
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