LAPO AN PRAKTIKUM BIOKIMIA PENETAPAN KADAR PROTEIN SECARA B URET
PERCOBAAN VI PENETAPAN KADAR PROTEIN SECARA BIURET
I.
TUJUAN
Dapat menetapkan kadar protein dengan metode Biuret.
II.
DASAR TEORI
Protein berasal dari kata Yunani kuno proteos artinya “yang utama”. Dari asal kata ini dapat diambil kesimpulan kesimpulan bagaimana pentingnya protein dalam dalam kehidupan. Protein terdapat terdapat pada semua sel hidup, kira-kira 50% dari berat keringnya dan berfungsi sebagai pembangun struktur, biokatalis, hormon, sumber energi, penyangga racun, pengatur pH, dan bahkan sebagai pembawa sifat turunan dari generasi ke generasi (Girindra, 1993). Protein merupakan polipeptida berbobot molekul tinggi. Protein sederhana hanya mengandung asam-asam amino. Protein kompleks mengandung bahan tambahan bukan asam amino, seperti derivat vitamin, lipid atau karbohidrat. Protein berperan pokok dalam
tertentu berbanding berbanding lurus dengan dengan kadar protein dan cara ini sering dipakai dalam dalam pengujian protein (Montgomery, 1993). Kerugian dari metode ini adalah hasil penetapannya tidak murni menunjukkan kadar protein, melainkan bisa saja kadar senyawa, yang mengandung benzena, gugus fenol, gugus sulfhidrin, ikut terbaca kadarnya. Selain itu, waktu penetapan yang dipergunakan juga lama, sehingga sering kali dinilai kurang efektif (Lehninger, 1982).
III.
ALAT DAN BAHAN
1. Alat :
- Tabung reaksi
2.
Bahan :
- Reagen Biuret
- Gelas Beaker
CuSO4 (reage (reagen n A)
- Labu ukur
KI (reagen B)
- Pipet volume
Na-Sitrat,
- Glass firn - Vortex - Spektrofotometer
Na2CO3,
NaOH
(reagen C)
Aquadest
- Larutan stok albumin 10 mg/ml
3. Penyiapan sampel Pipet 1 ml albumin telur, masukkan dalam labu ukur 10,0 ml Encerkan dengan aquadest hingga batas
Replikasi sampel 3 kali 4. Pembua Pembuatan tan kurv kurvaa baku baku dan peny penyiap iapan an samp sampel el Semua seri larutan baku dan sampel ditambahkan reagen Biuret
Vortex sampai homogen
Diamkan selama 30 menit pada suhu ruang
Ukur absorbansi pada λ 540 nm
Catat hasil pengamatan dan analisis
V.
DATA DA DAN AN ANALISIS DA DATA
Stok
Aquadest
Reagen
Konsentrasi
Absorbansi sampel
Konsentrasi sampel
̅
No.
− ̅
|
− ̅|
(y)
(x)
1.
0,378
2,081
*
-0,408
0,166
2.
0,382
2,106*
-0,383
0,147
3.
0,464
2,604
0,115
0,013
4.
0,467
2,622
0,133
0,018
5.
0,467
2,622
0,133
0,018
6.
0,451
2,525
0,036
1,296 x 10
7.
0,448
2,507
0,018
3,24 x 10
8.
0,464
2,604
0,115
0,013
9.
0,484
2,726
*
0,237
0,056
2,489
* = kadar kadar sampel sampel yang tidak tidak masuk masuk range
=
∑|
− |̅ 0,43262 = = 0,2325 −1 9−1
/
∑|
− ̅| =
0,43262
-3
-4
VI.
PEMBAHASAN
Pada percobaa percobaan n kali ini, praktikan praktikan melakuka melakukan n penetapan penetapan kadar protein protein secara secara Biuret dengan dengan menggunakan spektrofotometer. spektrofotometer. Prinsipnya adalah adalah pengukuran serapan cahaya cahaya oleh ikatan kompleks berwarna ungu yang yang terjadi bila protein bereaksi bereaksi dengan ion Cu2+ dalam suasana basa. Reaksi Biuret menggunakan menggunakan 3 macam reagen, yaitu reagen reagen A, B, dan C. Reagen A terdiri dari CuSO4 dalam dalam aquade aquadest. st. CuSO CuSO4 ini berfungsi sebagai penyedia ion Cu
2+
yang nantinya akan
membentuk kompleks dengan dengan protein. Reagen B mengandung mengandung KI dalam aquadest. KI ini berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu
2+
sehingga tidak mengendap. Sedangkan pada reagen C
terdiri dari Na-sitrat, Na2CO3, dan NaOH NaOH.. Na-sitr Na-sitrat at dan Na Na2CO3 berfungsi berfungsi sebagai sebagai buffer buffer dan NaOH berfungsi untuk menyediakan suasana basa. Suasana basa akan membantu membentuk Cu(OH) 2 2+
yang nantinya akan menjadi Cu
-
dan 2OH .
Pada saat sampel di-vortex, tidak boleh boleh sampai menimbulkan menimbulkan buih agar tidak mempengaruhi pengukuran absorbansi. absorbansi. Penetapan kadar protein dengan dengan reaksi Biuret tidak spesifik karena metode metode ini didasarkan pada ikatan peptida bukan pada senyawa kompleks warna seperti Lowry. Setelah ditetesi Biuret, Biuret, sampel didiamkan didiamkan selama 30 menit. 30 menit ini merupakan merupakan OT (operating time), yaitu waktu waktu yang dibutuhkan agar seluruh reaktan/ reaktan/ protein bereaksi bereaksi seluruhnya dengan reagen. Setelah 30 menit, menit, maka sampel diukur absorbansinya absorbansinya pada panjang gelombang gelombang 540 nm menggunakan spektrofotometer. Panjang gelombang 540 nm ini merupakan panjang gelombang
mg/mL), dan sampel sampel 9 (2,726 mg/mL). mg/mL). Keadaan yang tidak sesuai dengan rentang rentang kadar larutan larutan baku dapat dipengaruhi beberapa faktor antara lain : 1. Parti artik kel Besar kecilnya partikel dapat menyebabkan pemantulan. Pemantulan ini akan mempengaruhi besarnya absorbansi. Makin besar partikel, absorbansi makin besar juga. 2. Ada Ada tidakn tidaknya ya gelem gelembun bung g Saat pengukuran absorbansi tidak boleh ada gelembung. Gelembung yang ada akan menimbulkan pembiasan cahaya. Pembiasan ini akan mempengaruhi besarnya absorbansi. Semakin banyak gelembung, absorbansi akan semakin besar. 3. Tidak adanya adanya pengadukan pengadukan untuk untuk menghomoge menghomogenkan nkan larutan. larutan. Tidak adanya pengadukan mengakibatkan adanya sampel yang tidak bereaksi dengan CuSO 4. Adanya CuSO4 (berwarna biru) yang juga menangkap cahaya, akan menghasilkan nilai absorbansi tertentu sehingga terjadi penyimpangan pengukuran. 4. Pros Proses es pipe pipeti ting ng Proses pipeting yang tidak tepat, menyebabkan nilai absorbansi yang terukur pada alat spektrofotometer mengalami penyimpangan. 5. Penc Pencuc ucia ian n alat alat Pencucian alat yang tidak bersih, memungkinkan masih adanya zat pengotor yang terdapat
VII.
KESIMPULAN
1. Kadar Kadar prote protein in dapat dapat dite ditentu ntukan kan deng dengan an metod metodee Biuret Biuret.. 2. Prinsip Prinsip metode metode Biuret Biuret adalah adalah reaksi reaksi protein protein dengan dengan ion Cu Cu2+ pada suasana basa yang menghasilkan warna ungu dan absorbansinya diukur pada λ 540nm. -2
3. Didapa Didapatka tkan n persa persamaa maan n kurva kurva baku baku y = 0,16 0,1645 45 x + 3,56 3,56 x 10 dari standar yang telah dibuat. 4. Larutan Larutan standar standar dibuat dibuat dari serum serum albumin albumin murni murni yang yang dilarutkan dilarutkan dalam dalam aquadest aquadest dan mg
diperoleh konsentrasi 10 / mL mL. 5. Rentang/ Rentang/ range range kadar yang yang diperoleh diperoleh dari dari percobaa percobaan n ini adalah adalah 2,2565 2,2565 mg/mL mg/mL – 2,7125 mg/mL, yang tidak masuk masuk rentang kadar sampel sampel adalah sampel 1 (2,081 mg/mL), sampel 2 (2,106 mg/mL), dan sampel 9 (2,726 mg/mL).
VIII.
DAFTAR PUSTAKA
Carpette, 2005, An Introduction to Practical Biochemistry, 100-101, Mc Graw Hill Book Company, Great Britany Girindra, A., 1993, Biokimia I , 66-73, PT Gramedia Pustaka Utama, Utama, Jakarta Harper , 47-50, EGC, Jakarta Harper, M., 1995, Biokimia Harper th Harrow, 1954 , Textbook of Biochemistry 6 Edition, 48, 108, Saunders Company,
0,6
(sampel 4 dan5)
0,5
(sampel 6) (sampel 9) (sampel 2)
0,4
(sampel 3 dan 8) (sampel 7)
) s b
(sampel 1)) a ( n
s
i
0,3 b
a
(standar 5)
r o s b
y = 0,1645x + 3,56 x 10
-2
r = 0,99011 A
0,2
(standar 4) (standar 2) 0,1
(standar 3) 3)
(standar 1)
0 0
0,5
1
1, 5 Kadar Protein (mg/mL)
2
2,5
3
