EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ADN DE LEVADURA LEVADURA UNIVERSIDAD DE NARIÑO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA RESUMEN: Se RESUMEN: Se realizó una práctica de extracción y caracterización de ADN a partir de levadura por un método consistente en cuatro pasos; el rompimiento celular se llevo a cabo con arena y la extracción inicial del ADN se llevo a cabo en baño de hielo con SDS y EDA! EDA! "a desnat desnatura uraliz lizaci ación ón de las prote# prote#na nass se llevo a cabo cabo con una solució solución n de cloro$ormo%alcohol cloro$ormo%alcohol isoam#lico isoam#lico y posterior centri$u&ación centri$u&ación a '((( rpm! "a extracción )nal )nal del ADN se lo&ro mediante mediante precipitación precipitación con etanol! etanol! El ADN obtenido correspondió correspondió a un sólido sólido de color amarillo amarillo y aparienci apariencia a coloidal coloidal muy soluble soluble en a&ua! "as pruebas pruebas de caracterización de ADN $ueron positivas para la identi)cación &eneral de ADN por el método método de *eul&en% *eul&en%Sch Schi+ i+ y la prueba de $os$atos! $os$atos! "a prueba prueba de desoxipe desoxipentos ntosas as con di$enilamina presentó un resultado ne&ativo debido a la contaminación del reactivo de di$enilamina, debido a esto se utilizó una prueba con el reactivo de -ial .ue presentó un resultado positivo!
INTRODUCCIÓN "a in$ormación .ue permite vivir a los seres eres vivo vivoss es esttá conte onteni nida da en los los ácidos nucle#cos! Estos son macr macrom omol oléc écul ula as comp co mpue uesstas por por nucleótidos, .ue tienen en su estructura un az/car 0ribosa o desoxirrib desoxirribosa1 osa1,, una base nitro&enad nitro&enada a 0adeni 0adenina, na, &uanin &uanina, a, citosi citosina, na, timina timina,, uracilo1 lo1 y un &rupo $os$at $ato! En principio, se&/n el az/car .ue $orma su es.ueleto se distin&uen dos tipos de ác ácid ido os nucle ucle#c #cos os22 el ADN ADN, co con n desoxirribosa y el A3N, con ribosa! El ADN contiene la in$ormación &enética neces esa aria para la s#ntes esiis de las prote#nas .ue $orman los seres vivos y llev lleva an a cabo abo todos odos los los proc proces esos os )sioló&icos de los seres vivos! El A3N tiene diversas $unciones siendo una de las las prin princi cipa pale less el tran transp spor orte te de la in$o in$orm rmac ació ión n desd desde e el ADN ADN hast hasta a la ma.u ma.uin inar aria ia dond donde e se prod produc ucen en las las prote#nas! A nivel estructural encontramos .ue mientras el ADN se encuentra encuentra mayoritariamen mayoritariamente te $ormado $ormado por una doble hélice con dos hebras complementarias, el A3N está $ormado por moléculas de una sola hebra .ue se plie&an sobre s# mismas ad.uiriendo estructuras internas! 041 En su es estr truc uctu tura ra se secu cund ndar aria ia,, y de acuerd erdo a los diver iverssos es esttudios )sic )sico. o.u# u#mi mico cos, s, el ADN ADN en so solu luci ción ón acuosa ha demostrado .ue se trata de un pol#mero de elevado peso molecular 05 x 4(61 y .ue o$rece una
con)&urac ació ión n más bien r#&i #&ida y distendida! Entre las consecuencias de su elev elevad ado o peso peso mole molecu cula larr y de la ri&idez de sus moléculas se destaca la elevad ele vada a viscos viscosida idad d de las sol soluci ucione oness acuosas de ADN! 7na solución de ADN tiene una densidad mucho mayor .ue la del a&ua! a&ua! 8tra consecu consecuencia encia de de las citadas propiedades de la molécula de ADN es la &ran $acilidad con .ue las $uer $uerza zass de $ric $ricci ción ón redu reduce cen n su peso peso molecular por rotura de su cadena! Es prác práctic ticam ament ente e impo imposi sibl ble e obte obtene nerr a partir partir de materia materiall bioló& bioló&ico ico ADN sin .ue ten&a cierto &rado de $ricción, por lo .ue es muy probable .ue los pesos moleculares del ADN aislado 05 x 4( 61 ten&an poco .ue ver con el tamaño de la molécula del ADN in vivo! El ADN )broso aislado tiene un modelo de di$ra di$racc cció ión n de rayos rayos 9 muy muy neto neto,, indi indici cio o expe experim rimen enta tall dire direct cto o de una una estruc estructur tura a sec secund undari aria a muy re&ul re&ular ar!! :atson y ric< propusieron en 4=5' una estruc estructur tura a sec secund undari aria a del ADN, ADN, .ue .ue dedu dedu>er >eron on de ésto éstoss mode modelo loss de di$racción de rayos 9, y .ue estaban de acuerdo con las observaciones de har&a+, mostrando .ue ciertos pares de bas base de ADN ADN, se pres presen enttan en cant ca ntid idad ades es e.ui e.uimo mole lecu cula larres es!! Esta Esta estr estruc uctu tura ra de :atso atson n y rac< rac< está está constituida por dos cadenas de ADN .ue .ue se enro enrolla llan n helic helicoi oida dalme lment nte e en torno a un e>e central com/n, ori& ori&ina inand ndo o una una moléc molécul ula a de ca cade dena na doble y de unos ?( @ de diámetro! "as
cadena cade nass de az/c az/car ar%$ %$os os$a $ato to es esttán situadas en la parte externa de estas hélic hélices es orien orienta tadas das co con n dire direcc cció ión n de enrollamiento a la derecha; las bases pur#nicas y pirimid#nicas se encuentran enlazadas por puentes de hidró&eno, en la part parte e int interna erna de las las cita citada dass hélices, con los planos de sus anillos orientados perpendicularmente al e>e central! Sólo se tolera el apareamiento de bases entre la adenina y la timina o entre la &uanina y citosina! 0?1 Debido a .ue el ADN es la molécula .ue almacena la in$ormación precisa para .ue un ser vivo pueda llevar a cabo todas las $unciones .ue necesita, su aislamiento de células y te>idos es el primer paso en muchas investi&aciones en biolo&#a! El aisl islamien iento del ADN tambié mbién n es empleado en diversos campos como la medicina, la biotecnolo&#a o la crim crimin inol olo& o&#a #a para para obte obtener ner me me>or >ores es terapias, me>orar cosechas o identi)car individuos! uando se habla del ADN hay .ue di$erenciar el ADN &enó &enómi mico co,, .ue .ue se encu encuen entr tra a en el n/cleo y contiene la mayor#a de los &ene &enes, s, de los los ADNs ADNs extr extran anuc uclea leare res, s, .ue se encuentran en la mitocondria y el cloroplasto y contienen la in$o in$orrmac mación ión de ciert iertas as prot prote# e#na nass necesarias para el $uncionamiento de esos or&ánulos celulares! 041 En el presente in$orme se muestra un méto mé todo do de extra xtracc cció ión n del del ADN ADN de levadura en cuatro $ases2 41 3otura de las células de levadura! ?1 o omo mo&e &ene neiz izac ació ión n del del extr extrac acto to en pres presen enci cia a de dete deter& r&en ente te y EDA! '1 Desnaturalización de las prote#nas li&adas al ADN! B1 Crecipitación del ADN con etanol!
MATERIALES Y MÉTODOS Extracción del ADN
Se pesaron pesaron 5 & de levadura seca y ' & de arena para ser macerados en un
mortero durante 5 min hasta de>ar la leva levadu dura ra muy muy )na! na! El sólid ólido o $ue tras trasva vasa sado do a un erle erlenm nmey eyer er de 5(( 5(( m" con tapa 0las operaciones si&uientes se realizaron dentro de un baño de hielo1 y se adicionaron '( m" de solución salina de EDA! Costeriormente se adicionaron ? m" de SDS al ?5 y, en el baño de hielo, hielo, se a&it a&itó ó la mezc mezcla la dura durant nte e ? min! min! A cont co ntin inua uaci ción ón se ca cale lent ntó ó el co con> n>un unto to durante 4( min a 6( en un baño de a&ua con a&itación suave! "a me mezc zcla la se en$r en$rió ió a temp temper erat atur ura a ambiente y se adicionaron 5 m" de per perclor clorat ato o de so sodi dio o 6 F, a&it a&itan ando do $uer $uerte teme ment nte e para para co con nse se&u &uir ir una dist distrib ribuc ució ión n rápida rápida y uni$o uni$orm rme! e! Se adic adicion ionar aron on B( m" de clor cloro$ o$or ormo mo y alcohol isoam#lico 0?B241 a la mezcla y se a&itó el con>unto durante 45 min! "a emulsión resultante se centri$u&ó a '((( rpm rpm durante durante 4( min! min! Se reco&ió reco&ió con cuidado la $ase superior sobrenadante con una pipeta, evitando arrastrar los precipitados de la inter$ase! El sobrenadante $ue trans$erido a un matr matraz az de ?5( ?5( m" co colo loca cado do en un baño de hielo, se añadieron lentamente G( m" de etanol sobre la solución pro procuran rando no mezc ezclar demasiado el l#.uido contenido en el matr matraz az!! A conti continu nuac ació ión, n, con con una una varilla de vidrio se a&itó suavemente el con>unto observando la prec precip ipit itac ació ión n del del ADN ADN en $or $orma de )bras blan.uecinas dentro del matraz! Se extra>o una pe.ueña cantidad del ADN y disolvió en ' m" de a&ua y (!5 m" de solución salina de EDA para utilizarlo en las pruebas de identi)cación del ADN! Prueb ruebas as ADN
de
cara ca ract cter eriz izac ació ión n
del del
Solu Soluci cion ones es de ác ácid idos os nu nucl cleí eíco cos: s:
on el ADN obtenido se preparó 4( m" de una solución de ácido nucleico al 4 aproximadamente!
Prueba Prueba de fosfatos: fosfatos: A 4 m" de la
solución de ácido nucleico se a&re &re&aron ? m" de molibdato de amonio y 4 m" de cloruro estannoso hasta observar la aparición de un color azul .ue indica la presencia del &rupo $os$ato! Prueba para desoxipentosas: a1 A 4
m" de la solución solución de ácido nucleico se adicionaron ? m" de ácido tricloroacético al 4( y se calentó el con>unto en baño mar#a durante unos 45 min! Cos Costerior teriormente mente se se a&re&aron a&re&aron 6 m" de di$e di$eni nila lami mina na a&it &itando ando la solución y de>ándola otros 4( min en el baño mar#a hasta observar el desarrollo de una coloración azul .ue indica la presencia de una ?% desoxipentosa! b1 A 4 m" de la solución de ácido nucleico se adicionaron ? m" de ácido tric riclor loroa oacé céti tico co al 4( y ? m" del del reactivo de -ial colocando la solución en baño mar#a durante al&unos minuto minutoss hasta hasta observa observarr el desar desarro rollo llo de una coloración verde .ue indica un resultado positivo para la prueba! Reacción de FeulgenSc!i": En un
tubo de ensayo se colocaron ? m" del reactivo de Schi+ y se a&re&aron ? m" del hidrolizado colocando el tubo en un baño mar#a durante 5 min hasta observar la $ormación de una coloración azul .ue indica un resultado positivo para la prueba!
ANÁLISIS ANÁLISI S DE RESULT RESULTADOS El método de extracción del ADN de levadura permitió la obtención de un precipitado amarillo .ue presentó una solubilidad apreciable en a&ua, debido probablemente a la presencia de los muchos &rupos $os$ato $os$ato aniónicos aniónicos en la 0'1 molécula molécula de ADN ! El primer paso de la extracción permitió la ruptura de las célu élulas las de leva levadu dura ra por por un me medi dio o $#sico $#sico,, la $ricci $ricción ón con con arena! arena! El SDS SDS utilizado como deter&ente permitió la de&r de&rad adac ació ión n de los los co comp mpon onen enttes celulares para permitir la liberación del ADN!
El EDA imp impide la prec ecip ipiitación temprana del ADN atrapando cual.uier ion ion prese present nte e en la soluc solución ión!! En los los or&a or&ani nism smos os euca eucarió rióti tico coss el ADN ADN se halla asociado con al&unas prote#nas llamad lla madas as histon histonas, as, estas estas prote prote#na #nass y cual cual.u .uier ier otro otro tipo tipo de impur impurez ezas as de tipo protéico pueden ser desn desnat atur ural aliz izad adas as por por la ac acci ción ón del del clor loro$ormo, mo, sepa eparándose de las las moléculas de ADN .ue permanecen en la $racción de alcohol alcohol isoam#lico, isoam#lico, estas part#cu #culas proteica icas pueden ser se sepa para rada dass del del extr extrac acto to de ADN por por medio del proceso proceso de centri$u&aci centri$u&ación ón a '((( '((( rpm! *inalme inalmente nte la adici adición ón de etan etanol ol 0un 0un disol disolve vent nte e co con n polar polarid idad ad medi me dia1 a1 perm permit ite e la prec precipi ipita taci ción ón del del ADN a partir del extracto obtenido obtenido por medi me dio o de la ce cent ntri$ ri$u& u&ac ación ión,, el ADN ADN obtenido por medio de este método no esta estará rá co comp mplet letam amen ente te puri) puri)ca cado do y existirán existirán $racciones $racciones considerabl considerables es de A3N y al&unas otras impurezas adheridas a él! "os resultados obtenid enido os en las pruebas de caracterización del ADN se resumen en la abla 42
Tabla 1. R!"l#a$%! $ la! &'"ba! $ (a'a(#')*a()+, $ ADN. D!%/)&,# %!a! a1 b1 % H
-%!a# %! H
-"l0, S(2)3 H
H I positivo % I ne&ativo
"a reacción &eneral .ue se presenta en la prueba de $os$atos podr#a ser representada de la si&uiente manera2 O
O R O P
O
+ (NH4)2MoO4
O NH4 + MoO42-
R O P
O NH4
O
O
O R O P
O NH4 + SnCl2
O NH4
R O P O
O
+ 2Cl
Sn
Azul
"a rea eacc cció ión n pro produce duce un co colo lorr azu azul intenso al a&re&ar el cloruro estannoso, si se a&re&a una cantidad insu)ciente del reactivo no se $ormará el
compuesto con el estaño y por tanto no se apreciará el cambio de color en la solución, $ormándose una coloración verde%azul! En la prue prueba ba de deso desoxi xipe pent ntos osas as la reacción a1 .ue se realizó con di$enilamina en medio ácido se podr#a representar as#2 HOH2C
OH
O
H+
H N
Complejo !
OH Di#enilamina
Β-D-2-Desoxirribosa
Esta reacción dió un resultado ne&a ne&attivo ivo para para la mues uestra debid ebido o prob probab ablem lemen ente te a .ue .ue el reac reacti tivo vo de di$enilamina se encontraba contaminado, lo cual habr#a impedido la $ormación del comple>o de colo co lora raci ción ón azul azul!! Debi Debido do a esto esto $ue nece necesa sari rio o util utiliz izar ar otra otra prue prueba ba para para rea eali liza zarr la ca cara ract cter eriz izac ació ión n de la ?% desoxipent desoxipentosa! osa! "a prueba se realizó realizó en presencia del reactivo de -ial! "a prueba con el reactivo de -ial es caract caracter#s er#stica tica para para las las pentos pentosas! as! "a reacción &eneral .ue se presenta es la si&uiente2 HC O CH2 HC OH
HC O C
H+
CH
HC OH
CH
CH2OH
O
$ur#ural
CH% OH $e%+
CHO
$ur#ural
CONCLUSIONES El extracto de ADN obtenido de la muestra de levadura correspondió a un sólido ido de color amari arillo llo de apar aparien ienci cia a co colo loid idal al .ue .ue pres presen entó tó una solubilidad apreciable en a&ua! Est Este extra xtraccto repr epres esen entta en su mayor parte ADN, sin embar&o, es muy probable .ue esta muestra no se encuentre totalmente pura y .ue conten&a conten&a cantidades cantidades considerabl considerables es de impurez impurezas as como como A3N! A3N! Debido Debido a esto es to el mé méto todo do pres presen enta tado do en la presente practica podr#a ser utilizado como un método de extracción inicial siendo necesarios otros procedimientos de puri)cación 0como utilización de enzimas1 para obtener un ADN mucho más puro! "as pruebas de caracterización de ADN mostraron resultados positivos en todo todoss los los ca caso soss exce except pto o en la prueba de reconocimiento de pentosas por medio de la reacción con di$enilamina debido, proba probabl bleme ement nte, e, a .ue .ue el reac reacti tivo vo utilizado no se encontraba completamente puro!
HC
2-D-"esoxiribosa
O
0$ucsina básica1 de color 0B1 caracter#stico ! En es este ca caso, la la prue prueba ba posi positi tiva va se evide evidenc nció ió por por la $ormac $ormación ión de una colora coloració ción n violet violeta a intensa!
Complejo !er"e
OH Or&inol
"a reacción de *eul&en%Schi+ es una prueba utilizada para la identi)cación de ADN! ADN! En &enera &eneral, l, const consta a de una una hidr hidról ólis isis is ac acida ida en pres presen enci cia a de un ácido mineral 0com/nmente l1 para eliminar las bases del ADN de>ando los extremos aldeh#dicos libres para .ue estos puedan reaccionar $ormando un comp co mple le>o >o co con n el rea eact ctiv ivo o de Schi Schi+ +
4I4LIO5RA-ÍA 041 Fart#n Fart#nez, ez, J!J! "! Extrac Extracció ción n de ADN! ADN! -iol -iolo& o&#a #a22 ien ienci cias as Ambi Ambien enta tale les! s! 7NED 7NED!! Féxi Féxico co,, 4=K5 4=K5!! Cá&! á&! =K L 4(4! 0?1 0?1 "u.u "u.ue, e, E! -io. -io.u# u#mi mica ca Desc Descri ript ptiv iva! a! 7DENA3! Casto, 4==5! Cá&! 4K6 L 4KK! 0'1 -ohins
