MACROMOLÉCULAS DE LA LEVADURA. Fernando Chaves., Lady Arciniegas., Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Naturales y matemáticas, 9 de agosto del 2007. RESUMEN:
Se extr extraj ajo o e iden identi tifi fico co cual cualit itat ativ ivam amen ente te las las prin princi cipa pale les s macromoléc macromoléculas ulas (proteína (proteínas, s, ácidos ácidos nucleícos nucleícos y glucógeno) glucógeno),, presentes presentes en las células de sacharomyces spp (levadura de panadería). Para su identificación se realiz realizaro aron n prueba pruebas s cualit cualitati ativas vas resulta resultando ndo positi positivas vas para para cada cada molécu molécula la anal analiizada, ada, ademá demás s se deduj edujo o un ord orden de abund undanc ancia de est estos tres tres componentes analizados en la levadura en donde se evidencia mayor cantidad de proteínas presentes seguida de glucógeno y por ultimo ácidos nucleicos.
PALABRAS CLAVES: Macromoléculas de la levadura, lugol, reactivo de orcinol.
INTRODUCCIÓN: Se denomina denomina levadura levadura a cualquiera cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de carbo carbono, no, produc producien iendo do distin distintas tas sustancias, estos organismos suelen esta estarr unid unidos os entr entre e sí form forma ando ndo cadenas, además producen enzimas capace capaces s de descom descompon poner er divers diversos os sust ustratos, principalmente nte los azúcares. Las levaduras se rep reproduce ucen asexualmente nte por gemación o brotación y sexualmente mediante ascosporas o basidioesporas. basidioesporas. Durante la repro reprodu ducc cció ión n asex asexua ual, l, una una nuev nueva a yema yema surg surge e de la leva levadu dura ra padr padre e cua cuando ndo se dan las las condic ndicio ione nes s adecuadas, tras lo cual la yema se sepa separa ra del del padr padre e al alca alcanz nzar ar un tamaño tamaño adulto adulto.. En condic condicion iones es de escasez de nutrientes las levaduras que que son son capa capace ces s de repr reprod oduc ucir irse se sexualmente formarán ascosporas.1
Compos Composici ición ón bioquí bioquímic mica a de las levaduras:
Proteínas:
El contenido de proteína eínas s de la levadura es el elemento nutricional más impo import rtan ante te y se las las ha llama lamado do prot proteí eína nas s unic unicel elul ular ares es.. Tal Tal vez vez el nombre más apropiado seria BIOMASA MICROBIANA; que al degradarse por las enzimas digestivas, son hidrolizadas a amin aminoá oáci cido dos s post posteri erior orme ment nte e son son reconstituidas para formar enzimas y otros compuestos nitrogenados. Las proteínas de la levadura pres present entan an elev elevad ado o cont conten enid ido o de lisina lisina,, isoleuc isoleucina ina y treoni treonina. na. Debe Debe dest destac acar arse se que que cont contie iene ne nive nivele les s menore menores s de metion metionina ina y cisteí cisteína, na, amino minoá ácido idos azuf zufrado rados s que que se hall hallan an en mayo mayorr cant cantid idad ad en las las proteínas de origen animal. Del total de las las prot proteí eína nas s pres presen ente tes s en al levad levadura, ura, debe debe teners tenerse e en cuenta cuenta que que el 6-8% -8% se hall halla a comp compue uest sto o por ácidos nucleicos. Las levaduras Vitaminas: conti contiene enen n import important ante e canti cantidad dad de vitaminas hidrosolubles del complejo B. El complejo B incluye a las vitami vitaminas nas B1-B2B1-B2-B6, B6, niacin niacina a y ácido ácido fólico fólico,, biotin biotina-p a-pant antote otenat nato; o; sus funciones son las de participar en reacciones enzimáticas como co-
enzimas (B1, B6, niacina, biotina, ácido fólico y pantotenato); en la síntesis de ácidos nucleicos (biotina y ácido fólico) y como activadores de funciones de la respiración celular (B2 y niacina).
Minerales
y
Oligoelementos:
Predominan en la levadura los FOSFATOS y el POTASIO; también presenta un contenido relativamente alto de elementos bioquímicamente importantes como azufre, magnesio y calcio. Lípidos: El contenido en lípidos de las levaduras puede variar entre 4% y 7 % en base seca según las condiciones de propagación impuestas y las especies o cepas utilizadas. La especie Saccharomyces cerevisiae contiene una cantidad considerable de ácidos grasos insaturados que ayudan a controlar el colesterol. La levadura contiene además esteroles de distintos tipos moleculares y compuestos como la lecitina, ácido oleico y ácido linoleico. Carbohidratos: La cantidad total de carbohidratos está en el orden del 30% a 35 % de sustancia seca. Son principalmente carbohidratos de reserva tales como glicógeno y trealosa; el material estructural de la pared celular son polímeros de glucosa y manosa (glucanos y mananos) muy poco asimilables por el hombre.2
PARTE EXPERIMENTAL:
En un mortero se coloco una cucharada de levadura de pan y trazas de arena lavada para su posterior trituración durante 5 minutos., al triturado se adiciono 15 mL de acido tricloroacetico al 5% y se continuo con la maceración durante 3 minutos más, posteriormente se dejo que la arena se asiente y se decanto la suspensión para su posterior
centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos. Después de la centrifugación se decanto el sobrenadante en un tubo de ensayo, el tubo que contenía el sedimento se llevo a baño de hielo, al sobrenadante se adiciono alcohol etílico al 96% agitando en frio, la suspensión formada se centrifugo por 3 minutos a 5000 rpm, el sobrenadante se descarto y el sedimento se disolvió en 1 mL de agua. Al sedimento inicial que contenía proteínas y ácidos nucleídos se agrego 15 ml de cloruro de sodio al 10% agitando cuidadosamente, la suspensión resultante se calentó en baño de agua hirviendo por 10 minutos, al enfriarse se centrifugo durante 3 minutos a 5000 rpm, posterior a esto se decanto el sobrenadante obtenido y el precipitado se llevo a baño de hielo. Al sobrenadante se adiciono alcohol etílico al 96% frio, la suspensión formada se centrifugo a 5000 rpm durante 3 minutos, el sedimento se disolvió en 2 mL de amortiguador salino, mientras que en otro tubo se adiciono 1 mL de proteína y en un tercer tubo se agrego 2 mL de amortiguador salino solo, a cada tubo se adiciono reactivo orcinol calentando en baño de agua caliente hasta observar un color verde intenso en algún tubo. Al precipitado obtenido en la prueba anterior a la descrita, se adiciono 2 mL de solución de cloruro de sodio 0.15M para resuspender, en otro tubo se adiciono 2mL de solución salina sola, a cada tubo se adiciono sulfato cúprico 0.1 M y 2mL de hidróxido de sodio 10 M procurando mezclar bien.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
La levadura se trato con acido tricloroacetico con el propósito de separar el glucógeno de los ácidos nucleídos y proteínas, “la estructura del glucógeno es muy ramificada, está formada por varias cadenas que contienen de 12 a 18 unidades de α-glucosas, uno de los extremos de esta cadena se une a la siguiente cadena mediante un enlace α-1,6glucosídico, la importancia de que el glucógeno sea una molécula tan ramificada es que aumenta su solubilidad en disolventes de baja polaridad”3. Generalmente el acido acético es un disolvente bastante polar, no obstante si este acido contiene agentes desactivantes como halógenos en su cadena carbonada la polaridad de este compuesto va a disminuir considerablemente, el acido tricloroacetico se convierte en un buen solvente para el glucógeno porque la parte apolar de este acido solubiliza las cadenas carbonadas del glucógeno mientras que la función acido orgánico forma puentes de hidrogeno con los grupos OHaumentando la solubilidad del glucógeno, por esta razón al adicionar el acido se forman dos fases una liquida la cual contiene el glucógeno solubilizado y otra solida con proteínas y ácidos nucleicos precipitados. La centrifugación es necesaria para optimizar el proceso de decantación de estas dos fases evitando así que estas se vuelvan a mezclar. Al sobrenadante que se obtuvo se adiciono alcohol etílico al 96% con el propósito de precipitar el glucógeno, el etanol posee un grupo OH- el cual puede formar puentes de hidrogeno con los OH- del glucógeno lo que provocaría que el glucógeno se solubilice por esta razón es necesario realizar el
proceso de precipitación a bajas temperaturas para disminuir al máximo las interacciones entre estos dos grupos y por ende disminuir su solubilidad, las propiedades polares del etanol lo convierten en buen precipitante del glucógeno porque este alcohol no puede solubilizar las cadenas carbonadas que son apolares del glucógeno. Después de de la centrifugación el precipitado se deposito en un tubo para adicionarle lugol y de esta manera comprobar cualitativamente si las levaduras contienen glucógeno, se tomaron 3 tubos uno con agua destilada, otro con almidón y otro con glucógeno, a estos también se adicionaron lugol, si se supone que la muestra contiene glucógeno este debe sufrir una reacción positiva y similar a la del tubo patrón que contiene glucógeno y efectivamente así fue en ambas muestras se formo una solución de color café oscuro debido a la reacción positiva con el lugol este resultado confirma la presencia de glucógeno en la levadura, el almidón también reacciona con el lugol por que la solución se torna de color azul violeta. El sedimento que se obtuvo anteriormente el cual contenía proteínas y ácidos nucleicos se trato con cloruro de sodio, los ácidos nucleicos por poseer bases nitrogenadas y grupos fosfatos pueden solubilizarse en la solución acuosa de cloruro de sodio, pero su solubilidad es baja por esta razón es necesario elevar la temperatura del sistema para aumentar las interacciones entre las moléculas de soluto y solvente y de esta manera se favorezca la solubilidad de los ácidos nucleicos.
Después de la respectiva centrifugación y decantación, se separa el sobrenadante que contiene los ácidos nucleicos, el precipitado que contiene las proteínas se deja en baño de hielo para garantizar una mayor precipitación de estas moléculas. Los ácidos nucleicos se precipitan adicionando un solvente más débil en comparación con el medio acuoso de cloruro de sodio, este solvente es el etanol no obstante los grupos OH- de este compuesto van a solubilizar a ciertos grupos fosfatos y bases nitrogenadas, por esta razón es necesario disminuir la temperatura del sistema para desfavorecer la solubilidad entre estos dos compuestos. Después de la centrifugación el sedimento presento un color amarillo claro, este precipitado se disolvió en amortiguador salino, también se tomaron dos tubos como muestra patrón un tubo contenía albumina y el otro amortiguador salino, a los tres tubos se adiciono orcinol calentando en baño de agua hasta que se evidencie un color verde, para el tubo que contenía el amortiguador no ocurrió ningún tipo de cambio, de igual manera para el tubo que contenía los ácidos nucleicos no presento cambios, generalmente con el orcinol se puede detectar ribosa, pero aunque la prueba para ácidos nucleicos no haya dado positiva no se puede decir que las levaduras no poseen estos compuestos ya que todas las células tienen información genética aunque sea mínima en el núcleo, probablemente la reacción no se pudo evidenciar a macroescala pero seguramente a nivel microscópico pueden haber cambios notorios por efectos de esta reacción. El sedimento que contiene proteínas se trato con cloruro de sodio debido
a que entre estas dos especies no se presenta solubilidad se formo una suspensión, en otro tubo se adiciono solución salina sola, posteriormente a cada tubo se adiciono sulfato cúprico tornándose las muestras a color azul claro este color simplemente se debe a que el sulfato cúprico presenta el color mencionado y al estar en exceso torna las soluciones a este color, al adicicionar hidróxido de sodio la solución salina no sufre ningún cambio mientras que la suspensión que contiene la muestra de proteínas toma un color violeta. Al adicionar orcinol a una porción de la muestra que contenía proteína se observa que la solución sufre el mismo cambio que la muestra que contiene albumina, esta se puede considerar una prueba positiva para proteínas. Con base en lo anterior se puede deducir que las proteínas se encuentran en mayor proporción en las células de la levadura, esta suposición es lógica por las membranas celulares y demás organelos están formados en su mayoría por proteínas, el glucógeno es otra molécula que se encuentra en una gran proporción en estas células porque estas necesitan de estas moléculas para obtener energía, los ácidos nucleicos se encuentran en menor proporción porque estos ocupan tamaños supremamente pequeños en la célula.
CONCLUSIONES: -
Para la extracción de las diferentes macromoléculas presentes en la levadura es necesario modificar el medio de reacción aumentando o
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disminuyendo la temperatura con el propósito de favorecer y desfavorecer la solubilidad de ciertos compuestos. La prueba para determinar cuantitativamente la presencia de ácidos nucleicos no dio positiva, esto no significa que las levaduras no posean estos compuestos ya que todas las células tienen información genética, una probable causa del fracaso de esta prueba se puede deber a que los reactivos se encontraban contaminados o a errores en la manipulación del operario o simplemente que la reacción solo se puede evidenciar a nivel microscópico. Los resultados obtenidos muestran que estas células presentan un alto contenido de proteínas lo que indica que la mayoría de sus estructuras celulares están conformadas por estas moléculas, estas células también poseen concentraciones elevadas de glucógeno lo que sugiere que esta es su fuente principal de energía.
BIBLIOGRAFÍA: 1. Harper`s., Illustrater Biochemistry, 26º edition, pad 645646 2. Morrison, R; Boyd, R. Química Orgânica.5ª edicion.Ed. Pearson.Pag 948-950 3. Alberts., Johnson.,The Molecular Biology of the Cell., 4º edition., pag: 350 4. Blomberg, A. 2000. Metabolic surprises in Saccharomyces cerevisiae during adaptation to saline conditions: questions, some answers
and a model. FEMS Microbiol. Lett. 182:1-8. 5. Adler, L. & L. Gustafsson. 1980. Polyhydric alcohol production and intracellular amino acid pool in relation to halotolerance of the yeast Debaryomyces hansenii. Arch. Microbiol. 124:123-130.
