1. TITULO MICROPROPAGACION IN VITRO DE PLANTULAS DE PAPAS NATIVAS (Solanum andigenum L.) EN EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA
DE
LA
CARRERA
PROFESIONAL
DE
AGRONOMIA – UTEA UTEA- ABANCAY. 2. INTRODUCCION. El presente informe de Prácticas Pre-profesionales describe las actividades realizadas en el laboratorio de Biotecnología de la Universidad Tecnológica de los Andes, realizado desde el 7de octubre del 2013 al 31 de febrero del 2014 para cumplir un requisito académico y optar el grado de bachiller en Agronomía. Habiendo participado en tareas y actividades propias de la especialidad, tales como. La micro propagación in vitro de plántulas, específicamente en la micro propagación de plántulas de diferentes variedades de papas nativas, aspecto que ha permitido aplicar las capacidades asimiladas durante nuestra formación en la universidad, bajo condiciones reales de trabajo. tr abajo. Capacidades que se han afianzado y en algunos casos se han mejorado. Las prácticas se realizaron mediante la programación de actividades por parte del personal encargado del laboratorio de biotecnología, para que las ejecute el practicante, practicante, con supervisión y guía del mismo. Se espera que el presente presente informe de práctica de a conocer conocer en forma clara y dinámica las experiencias vividas y logros alcanzados.
1
3. UBICACIÓN 3.1.Ubicación Política: Región
: Apurímac
Provincia
: Abancay
Distrito
: Abancay
Centro poblado
: Las Américas.
Dirección
: Av. Perú N° 700
3.2.Ubicación Hidrográfica. Cuenca
: Apurímac
Sub – Cuenca
: Mariño
3.3.Ubicación Geográfica . Latitud
: 13°37´56”s
Longitud
: 72°53´14”w
Altitud
: 2414 m.s.n.m.
3.4. Institución. La institución en la que se realizó las prácticas es, en la Universidad Tecnológica de los Andes, Carrera Profesional de Agronomía. Entidad a la que pertenece el laboratorio de Biotecnología.
2
3. UBICACIÓN 3.1.Ubicación Política: Región
: Apurímac
Provincia
: Abancay
Distrito
: Abancay
Centro poblado
: Las Américas.
Dirección
: Av. Perú N° 700
3.2.Ubicación Hidrográfica. Cuenca
: Apurímac
Sub – Cuenca
: Mariño
3.3.Ubicación Geográfica . Latitud
: 13°37´56”s
Longitud
: 72°53´14”w
Altitud
: 2414 m.s.n.m.
3.4. Institución. La institución en la que se realizó las prácticas es, en la Universidad Tecnológica de los Andes, Carrera Profesional de Agronomía. Entidad a la que pertenece el laboratorio de Biotecnología.
2
4. OBJETIVOS. 4.1.OBJETIVO GENERAL.
Micropropagar plántulas in vitro de papas nativas ( Solanum andigenum L. ) en el laboratorio de biotecnología de la UTEA.
4.2.OBJETIVOS ESPECIFICOS
Micropropagar plántulas de papa nativas de las variedades Qeqorani, Yanasuytu, Qachunwaqachi, Amarillo Tumbay, Moro huayro, Camotillo, Duraznillo.
Reforzar habilidades y destrezas en el manejo de equipos e instrumental de laboratorio en la micropropagacion invitro de plántulas de papa. papa.
Adquirir conocimientos adecuados de Biotecnología Agricola para utilizarlas en el campo de acción del Ingeniero Agrónomo.
5. METAS. Las metas planteadas por el periodo de permanencia en el laboratorio de biotecnología fueron fueron las que se mencionan a continuación. continuación.
Propagar 1200 plántulas in vitro de variedades nativas las cuales se conservan como material biológico dentro del laboratorio.
Mantener los equipos e instrumentos de trabajos limpios y esterilizados para su uso constante en el laboratorio. l aboratorio.
6. REVISION BIBLIOGRAFICA. 6.1.Historia de la Biotecnología: Según, García (2002). La biotecnología no es nueva, sus orígenes se remontan a los albores de la historia de la humanidad. Nuestros ancestros ancestros primitivos iniciaron, hace miles de años durante la Edad de Piedra, la práctica de utilizar organismos organismos vivos y sus productos. La biotecnología es un término que se ha dado a la evolución y recientes avances de la ciencia de la genética. Esta ciencia se originó hacia finales del siglo XX con el trabajo de Gregor Johan J ohan Mendel.
3
"La historia realmente se inicia con las investigaciones de Charles Darwin, considerado como el padre de la biología moderna, que concluyó que las especies no son fijas e inalterables, sino que son capaces de evolucionar a lo largo del tiempo, para producir nuevas especies. La explicación de esta evolución, según sus observaciones, se basaba en que los miembros de una determinada especie presentaban grandes variaciones entre ellos, unos estaban más acondicionados al ambiente en que se encontraban que otros, lo que significaba que los más aptos producirían más descendencia que los menos aptos. Este proceso es conocido como selección natural, y suponía la modificación de las características de la población, de manera que los rasgos más fuertes se mantendrían y propagarían, mientras que los menos favorables se harían menos comunes y acabarían desapareciendo." desapareciendo."
6.2.La papa y su conservación conservación en el Perú: www.peruecologico.com.pe (2012) . Refiere que el el Perú es el país con mayor diversidad de papas en el mundo, al contar con 8 especies nativas domesticadas y 2,301 de las más de 4,000 variedades que existen en Latinoamérica. Además, nuestro país posee 91 de las 200 especies que crecen en forma silvestre en casi todo nuestro continente (y que generalmente no son comestibles). Según, Álvarez y Repo (1999), el Centro Internacional de la Papa (CIP) es la institución encargada de la conservación científica de la papa, y al mismo tiempo lo hace con otros tubérculos y algunas raíces. Su labor se inició en 1,971 y tiene como objetivos reducir la pobreza, aumentar la sostenibilidad ambiental y ayudar a garantizar la seguridad alimentaria en las zonas más pobres y marginadas. Por ello, con el fin de lograr sus objetivos, el CIP viene desarrollando tres formas de conservación in situ de dicho tubérculo: 1) A través de plantaciones en el campo 2) Con técnicas de cultivo in vitro 3) Por medio de la conservación de semillas El Centro Internacional de la Papa posee el banco genético de papa más grande del mundo, con más de 5,000 tipos diferentes, entre cultivadas y 4
silvestres, y a partir de ellas desarrolla formas mejoradas para un manejo más óptimo del recurso, sobre todo, en las regiones de montaña y, principalmente, en los Andes. En resumen, el CIP cuenta con muestras de todas las papas cultivadas del mundo y al menos con el 75% de las especies silvestres.
6.2.1. Clasificación taxonómica de la papa Según, Hawkes, (1990). La papa tiene la clasificación taxonómica que se describe a continuación Reino
: Plantae
Tipo
: Spermatophyta
Clase
: Angiosperma
Subclase
: Dicotiledoneas
Orden
: Tubiflorineas
Familia
: Solanaceae
Género
: Solanum
Especie
: tuberosum
Nombre Científico
: Solanum tuberosum
Nombre Vulgar
: Papa, patata, etc.
6.2.2. Descripción botánica: Harris, (1978) sostiene que la papa, pertenece a la familia Solanaceae, cuyo nombre científico es Solanum tuberosum . Es una planta herbácea, vivaz, dicotiledónea, provista de un sistema aéreo y otro subterráneo de naturaleza rizomatosa del cual se originan los tubérculos.
-Raíces: son fibrosas, muy ramificadas, finas y largas. Las raíces tienen un débil poder de penetración y sólo adquieren un buen desarrollo en un suelo mullido.
-Tallos: son aéreos, gruesos, fuertes y angulosos, siendo a los principios erguidos y con el tiempo se van extendiendo hacia el suelo. Los tallos se originan en la yerma del tubérculo, siendo su altura variable entre 0.5 y 1 metro. Son de color verde pardo debido a los pigmentos antociámicos asociados a la clorofila, estando presentes en todo el tallo. 5
-Rizomas: son tallos subterráneos de los que surgen las raíces adventicias. Los rizomas producen unos hinchamientos denominados tubérculos, siendo éstos ovales o redondeados. -Tubérculos: son los órganos comestibles de la patata. Están formados por tejido parenquimático, donde se acumulan las reservas de almidón. En las axilas del tubérculo se sitúan las yemas de crecimiento llamadas “ojos”,
dispuestas en espiral
sobre la superficie del tubérculo. -Hojas: son compuestas, imparipinnadas y con foliolos primarios, secundarios e intercalares. La nerviación de las hojas es reticulada, con una densidad mayor en los nervios y en los bordes del limbo.
-Inflorescencias: son cimosas, están situadas en la extremidad del tallo y sostenidas por un escapo floral. Es una planta autógama, siendo su androesterilidad muy frecuente, a causa del aborto de los estambres o del polen según las condiciones climáticas. Las flores tienen la corola rotácea gamopétala de color blanco, rosado, violeta, etc.
-Frutos: en forma de baya redondeada de color verde de 1 a 3 cm de diámetro, que se tornan amarillos al madurar.
6.3. Introducción al cultivo in vitro 6.3.1. Generalidades Según, Jimenez-Gonzalez (1998a). El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo. A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. 6
Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotos, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción. El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio), incluye muchas técnicas destinadas a introducir, multiplicar y regenerar, entre otros recursos, material vegetal o animal en condiciones controladas y asépticas. El cultivo in vitro, constituye un paso fundamental en la obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas o transgénicas, mediante técnicas de ingeniería genética. Es decir que existe una estrecha relación entre el cultivo de tejidos vegetales y la biotecnología moderna. Normalmente se utilizan cultivos de tejidos, seguido de la regeneración de la planta completa, y la subsiguiente expresión de los genes introducidos o transgenes.
6.3.2. Cultivo in vitro de material vegetal Muñoz (2003). Menciona que el cultivo de tejidos vegetales, es una descripción genérica que involucra diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo las de protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. Las primeras experiencias relacionadas al cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de 7
cultivo en condiciones asépticas y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias). Esta técnica tiene numerosas aplicaciones: -
Propagación masiva de plantas, especialmente beneficiosa para especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción.Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año
-
Obtención de plantas libres de virus.
-
Producción de semillas sintéticas.
-
Conservación de germoplasma: material de un conjunto de individuos que representa la variabilidad genética de una población vegetal.
-
Obtención de metabolitos secundarios.
-
Producción de nuevos híbridos.
-
Mejora genética de plantas, incluyendo obtención de plantas transgénicas.
-
Germinación de semillas.
-
Producción de haploides.
-
Estudios fisiológicos diversos.
6.3.3. Bases biológicas del cultivo de tejidos, totipotencialidad celular Thorpe (1995) afirma respecto del proceso de transformación vegetal, existen distintas técnicas para la transferencia de genes a las células vegetales, siendo las principales la interacción con bacterias del género Agrobacterium y el método de Biobalística. Una vez realizada la transformación genética por alguno de estos dos métodos, el paso 8
siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de regenerar plántulas a partir del explanto inicial transformado, proceso que se sustenta en el principio de “totipotencialidad celular ”. De aquí la importancia del cultivo in vitro como paso fundamental para la obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas. La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en distintos órganos de la planta. Básicamente, la reproducción asexual se puede realizar debido a que las células vegetales poseen un mecanismo de división mitótico, al igual que las células animales, mediante el cual cumplen sucesivas etapas de crecimiento y desarrollo. La división celular mitótica implica una replicación de los cromosomas de las células hijas, por lo que las mismas poseen un genotipo idéntico al de la célula madre. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. Así, las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta: -
Una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos 9
(llamados así porque son estructuras similares a un embrión pero que no se originaron por unión de gametos). -
Una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o embriones (embriones somáticos).
La primera respuesta se conoce como órgano génesis o embriogénesis indirecta (mediada por un estado de callo), mientras que la segunda respuesta se considera organogénesis o embriogénesis directa. Como se comentó previamente, el cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denomina explanto, como por ejemplo el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerará una o muchas plantas. La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y raíces u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales. Según, Villalobos y Thorpe (1991). El éxito en la propagación de una planta dependerá de lograr la expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática.
Para
lograrlo
debe
inducirse
primero
la
desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de este carácter sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana o peperonias mediante porciones de hojas. Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada, es la composición del medio de cultivo. 10
En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie y está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales.
Esos
compuestos,
denominados
reguladores
del
crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta.
6.3.4. Pasos para generar plantas a partir de explantos aislados. Haddad (1994) sostiene que para su aplicación es necesario ubicar e identificar las yemas presentes en la planta madre, lo cual permitirá que el sistema sea altamente eficiente. A continuación se describe de forma general los pasos a seguir para su aplicación.
Este proceso incluye varias fases: FASE 0: Preparación de la planta madre FASE I: Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia FASE II: Multiplicación de brotes FASE III: Enraizamiento FASE IV: Aclimatación
FASE 0: Preparación de la planta madre Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o 11
varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida.
FASE I: Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos. Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantes del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un bote de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantes.
FASE II: Multiplicación de los brotes Durante esta fase se espera que los explantes que sobre vivieron de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar.
FASE III: Elección de un medio de enraizamiento de los explantos Para enraizar los explantes se utilizan principalmente dos métodos:
Enraizamiento in vitro Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar. Este método permite ser mas flexible a la hora de escoger los brotes, ya que éstos obtienen del medio la fuente de energía para enraizar, y por tanto no es 12
necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis.
Enraizamiento ex vitro Los explantes se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse. Los explantes deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada con "fog-system" o "mist- system".
FASE IV: Aclimatación de los explantos enraizados Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación. Tanto si los explantes fueron enraizados in vitro como ex vitro, en el momento en que se extraen los explantes de los recipientes de enraizamiento están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Los explantes deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz.
13
6.3.5. Elementos necesarios para hacer
cultivo de tejidos
vegetales Albarracín (2008), mesiona que para llevar adelante este trabajo se necesitan equipamientos que generen las condiciones necesarias de esterilidad como los flujos laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así a la muestra con la que se desea trabajar. Figura 1. Flujos laminares para el cultivo de tejidos. Se observa uno de los modelos de fl ujo laminar que puede usarse para preservar la esterilidad de las muestr as.
Además, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser sólido o
líquido y
que está conformado
por
algún
agente
gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales (ver Tabla 1), que ayudarán a obtener una planta completa o un órgano vegetal en particular, a partir del explanto elegido (en condiciones de esterilidad). Algunos de los elementos mencionados pueden ser reemplazados por mezclas poco definidas en su composición (jugo de tomate, agua de coco, etc.), que pueden dar buenos resultados y generalmente resultan más económicas. La acidez de los medios de cultivo para plantas suele variar entre pH de 5 y 6.5. Luego, se regulan las condiciones de temperatura y de fotoperíodo (relación de horas luz y horas oscuridad). 14
Según sea el balance hormonal y otras condiciones de cultivo se puede propiciar la regeneración de distintos órganos o formaciones vegetales. Por ejemplo, si el balance de citoquininas/auxinas (ver Tabla 1) es mayor a 1, se favorece la generación de brotes, si es menor a 1, la generación de raíces, si es igual a 1, la formación de callos. Tabla 1. Composición de medios de cultivo para células vegetales. COMPONENTES Agua destilada
Fuente de carbono
Sustancias inorgánicas
Vitaminas
Hormonas y reguladores del crecimiento
Mezclas de sustancias poco definidas Materiales inertes
CARACTERÍSTICAS Y EJEMPLOS Representa el 95% del medio nutriente Generalmente se usa sacarosa. La fuente de carbono se necesita porque los explantos no son completamente autótrofos y no pueden cubrir sus necesidades con la fotosíntesis que pueden realizar in vitro. Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporción adecuada para la planta elegida. Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico, ácido nicotínico, entre otras. Auxinas: promueven la elongación celular, la formación de callos y raíces adventicias, inhiben la formación de brotes axilares adventicios y, a veces, inhiben la embriogénesis. Citoquininas: promueven la división celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales Otras: giberalinas, ácido absícico, etileno. Ejemplos: extracto de levadura, extractos vegetales. Usados como soporte. Incluyen agar, azarosa, otros polisacáridos, lana de vidrio, papel de filtro, arena.
Adaptada del Libro Biotecnología, UNQ 2006.
15
6.3.6. RELACIÓN DEL CULTIVO IN VITRO CON LA BIOTECNOLOGÍA 6.3.6.1. La Micropropagac ión Según, Villalobos y Thorpe (1991). La propagación de plantas in vitro es una técnica de la biotecnología muy utilizada en cultivos de importancia económica. Como fue mencionado anteriormente
permite
cultivar
células,
tejidos, órganos,
semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. Los cultivos son realizados por personal especializado, con agentes específicos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y en condiciones ambientales controladas (temperatura, humedad y luz) (figura 6). Una vez ajustados los protocolos para la especie o cultivo de interés, es posible automatizar el proceso de modo de llevarlo a escala industrial. La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. Se aplica en la producción
masiva
de
especies
hortícolas,
aromáticas,
medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales.
6.3.6.2.Ventajas de la micropropagación Mejía (1994). Mensiona las siguientes ventajas: -
Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.
-
Permite controlar las condiciones ambientales.
-
Permite estudiar diversos procesos fisiológicos.
-
Evita el riesgo de que proliferen agentes patógenos (se realiza en medios esterilizados).
-
Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios 16
reducidos. -
Permite la obtención de individuos uniformes.
-
Facilita el transporte del material. Fi gura 2. La micropropagación vegetal.
A
partir de una planta madre se obtienen numerosos explantos que sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darán lugar a nuevas plantas iguales o similares a la planta original,
permitiendo
su
multiplicación.
Adaptado de “Biotecnología ”, UNQ 2006 .
6.3.6.3.Desventajas del cultivo invitro. Mejía (1994) indica que se requiere de personal especializado, se requiere infraestructura y equipos especiales, La adquisición de productos químicos es costosa y difícil especialmente en países con pocos recursos, Difícil de instalar laboratorios “in vitro” donde no exista fluido eléctrico, l a escasa literatura relacionada al cultivo “in vitro” de especies forestales,
difícil respuesta inicial de algunas
especies o genotipos. Gonzales, (1998). Afirma que generalmente se requiere de 1 a 1.5 años para adecuar las condiciones a cada especie o genotipo. Los problemas que presenta el cultivo in vitro es: la contaminación es grave y vitrificación es una reacción de las plantas que las hace adquirir apariencia de vidrio. La única solución es hacer un subcultivo de material sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos que estén bien.
17
6.3.6.4.Cultivo de meristemos Segun, Jimenez-Gonzales (1998b). En la yema apical se encuentra un grupo de células que conforman el meristemo apical (con un tamaño entre 0.01 y 0.3 mm). Es un tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta y regenerar plantas completas.
Figura 3 . Cultivo de meri stemos. A partir de un meristemo aislado se puede obtener una planta completa. Adaptado de “Bi otecnol ogía ”, UNQ 2006.
El cultivo de meristemos tiene numerosas aplicaciones. Una de las más importantes es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona de tejido generalmente no está afectada por estos patógenos vegetales. Otra aplicación es la multiplicación vegetal de enorme potencial. A partir de una yema apical se pueden obtener 4 millones de claveles en un año. La técnica permite multiplicar especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas) o acelerar la producción de plantas bianuales.
18
6.3.7. CULTIVO
DE
CÉLULAS
Y
ÓRGANOS
VEGETALES EN BIORR EACTOR ES Radice, Silva (2004), sostiene que una vez obtenidos los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden disgregarse para obtener una suspensión de células. La misma puede utilizarse para generar embriones somáticos (la base de las semillas sintéticas) o puede directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios, que son compuestos químicos sintetizados por las células vegetales en determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias farmacéutica y alimenticia, entre otras. Por ejemplo, son metabolitos secundarios el mentol y las drogas anticancerígenos vincristina y taxol, algunos edulcorantes, entre otros. Los cultivos celulares se llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta capacidad (de unos pocos a miles de litros) diseñados para propiciar el crecimiento y/o la multiplicación de distinto tipo de células y/u órganos
.Fi gura 4 . Cultivo de cé lulas y órgan os vegetal es. A partir de un explanto se pueden establecer cultivos de cé lulas par a produci r compuestos de i nteré s o par a obtener embr ion es somáti cos y semillas artificiales, entr e múltiples aplicaciones. Adaptado de Bi otecnol ogía-UNQ , 2006.
19
Las raíces vegetales también pueden ser cultivadas en biorreactores, especialmente aquellas transformadas por Agrobacterium rhizogenes, que producen un aumento abrupto en el tamaño y ramificación de la raíz, aumentando así la biomasa, y por ende la cantidad de producto deseado. Un ejemplo de compuesto farmacológico producido por cultivo de raíces es el paclitaxel o taxol, que es utilizado como anticancerígeno.
6.3.8. ASPECTOS RELEVANTES EN EL CULTIVO IN VITR O Según, Mejía (1994). El cultivo in vitro es muy costoso, entre otros detalles porque no se puede mecanizar. Sólo son rentables aquellos laboratorios grandes y con mercado. La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatación en el laboratorio; en el invernadero y después una segunda aclimatación en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros sólo se encargan del primer paso.
Figura 5. Fase de aclimatación en invernadero
6.3.8.1.Aplicaciones prácticas en el cultivo in vitro Hurtado (1994). Mensiona que: Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas:
-
Micropropagación de estaquillas
-
Organogénesis de callos
20
Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas:
-
Cultivo de meristemos
-
Microinjerto in vitro Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro.
Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.
Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos.
Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc.
Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.
Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Teniendo ventajas como la de
homocigotos
y
producción
obtención de
rápida
híbridos.
6.3.9. Equipo y material necesario empleado en el cultivo in vitro -
Autoclave
-
Cámara de flujo laminar
-
Medio de cultivo 21
-
Planta
-
Cámara de cultivo Figura 6. Au toclave
Para esterilizar todo lo que vamos a utilizar:
agua,
material,
etc.
autoclave.
algunos se
nutrientes,
utiliza
la
olla
No se pueden meter
proteinas. Es como una olla a presión, pero de mayor tamaño, donde se controla la presión y la temperatura (hasta 120º). Figura 7 . Cámara de fl ujo laminar.
La cámara de flujo laminar es donde se realizan
todas
las
manipulaciones con la planta. Es un habitáculo con un operario en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.
. Figura 8. Medio de culti vo Se verte agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapón. Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco inclinado. . Fi gura 9 . Planta
El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminación, aunque se lave mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que haya menos infecciones.
22
Figura 10. Cámar a de cul tivo.
La cámara de cultivo es una habitación de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variación día-noche, etc.
6.3.10. Condiciones del cultivo in v itro Gonzales y Vilca (1998). Sostienen que: -
En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema más importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones.
-
En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas.
-
El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias.
-
Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo.
-
El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5.5 y 6.5.
-
Se necesita agar y medio sólido 0.6 – 0.9%.
-
El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.
-
El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en prepararlo. 23
-
En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son 2226ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 2830ºC para plantas tropicales.
-
Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte más juvenil o más adulta.
-
En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ahí la importancia del cierre.
6.3.11. Subcultivos o replicado Gonzales y Vilca
(1998). Refieren que cuando sembramos
microestaquillas en cultivo in vitro, no nos interesa que se emitan raíces ni hojas, sino que se produzca una proliferación (crecimiento) para obtener nuevas microestaquillas. Son lo que se denominan subcultivos. No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el material vegetal; tan sólo se hace 8-10 veces. Ocurre entonces lo siguiente: -
El medio nutritivo se agota y se seca.
-
El material vegetal ocupa todo el tubo.
-
Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias tóxicas).
-
El medio se hace líquido.
24
6.3.12. Fases del cultivo de meristemos Según, Gonzales y Vilca (1998). Consta de las siguientes fases: 1.
Toma un ápice meristemático (0,2-1 mm).
2.
Siembra en el medio de la magenta.
3.
Fase de proliferación: crecimiento de brotes. Subcultivos.
4.
Fase de enraizamiento (cambiar el medio).
5.
Primera fase de aclimatación. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plástico, bandejas de vidrio, etc.
6.
Segunda fase de aclimatación. Siempre en invernadero.
7.
Plantación en el campo.
6.3.13. Fases del cultivo de embriones Se utiliza mucho en manzano. 1.
Se desinfecta el fruto en alcohol. Se flamea.
2.
Se coge el embrión de la semilla.
3.
Se inocula en el tubo.
4.
A las 1-2 semanas, la planta está más o menos reconocible.
5.
Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatación.
25
6.3.14. Micropropagac ión Figura 11. Se parte de una yema, br áctea o axilar y se empieza a desarrollar en el medio de cul tivo.
Entre la fase de proliferación y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener más plantas). El número de subcultivos depende del material vegetal: Ejemplo de micropropagación de Kiwi. -
Se parte de un trozo de tallo.
-
Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote.
-
En la fase de proliferación intentamos obtener gran cantidad de brotes.
-
Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio.
-
Al aumentar la concentración de auxinas se obtienen plantas enraizadas.
-
Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo.
6.3.15. Cultivo de callo in vitro Según, Liu (1981). Se parte de un trozo de hoja o de tallo, bien de una planta madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro. El medio puede ser sólido o líquido. Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o también proembriones, que al unirse forman una estructura similar al embrión. A partir de entonces se desarrolla normalmente.
6.3.16. Obtención de plantas haploides Albarracín, (2008). Refiere que normalmente se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular. No se riega nunca por aspersión (riesgo de patógenos), siempre con regadera. De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un 26
cultivo; bien por embriogénesis u organogénesis. -
Embriogénesis: se forman células (poliembriones).
-
Organogénesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien
de tejidos de la antera (diploide), o bien del grano de polen (haploide).
6.3.17. Problemas en el cultivo in vitro Figura 16. Contaminación grave.
Gonzales y Vilca (1998). Sostiene que la vitrificación, es una reacción de las plantas que las hace adquirir apariencia de vidrio. La única solución es hacer un subcultivo de material sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos que estén bien.
27
7. MATERIALES y EQUIPOS 1. Material Vegetal Plántulas de papa in vitro de 1 - 3 meses de edad, entre ellas tenemos las variedades como: qeqorani, yanasuytu, qachunwaqachi, amarillo tumbay, moro huayro, camotillo, duraznillo.
2. Material de laboratorio. Magentas, mecheros, bandejas de plástico, pinzas, bisturí, tubos de ensayo, servilletas desechables de papel, placas Petri, cintas plásticas, marcador permanente, papel alumino.
3. Equipos Agitador magnético, autoclave, balanza analítica, cámara de flujo laminar, cámara de cultivo, cámara fotográfica, destilador, termómetro de máxima y mínima, pH-metro.
4. Reactivos Medio basal Murashige & Skoog mixture (MS), agar ash2 -4%, agua destilada, alcohol al 96ºC, cloro comercial, hidróxido de sodio, etanol.
28
8. METODO. Para la micropropagacion se usó el método de crecimiento mínimo in vitro, que
es uno de los más utilizados y constituye una alternativa de las técnicas
del cultivo de tejidos para mantener plántulas en mejores condiciones sanitarias. Mediante esta técnica se obtiene un estricto control sobre plagas y enfermedades al encontrarse el material confinado en un microambiente aséptico, también el sistema ocupa muy poco espacio y al propagarse clonalmente permite el mantenimiento del genotipo.
9. LABORES REALIZADAS. 9.1.RECONOCIMIENTO DE MATERIALES DE LABORATORIO. MATERIALES ▪ Lapicero ▪ Hojas ▪ Cuaderno ▪ Lapiz
PROCEDIMIENTOS Se observo a los siguientes materiales: ▪ Autoclave. ▪ Balanza Analítica. ▪ Pipetas. ▪ Buretas. ▪ Vasos de precipitación ▪ Probetas 25 y 50 ml. ▪ Cepillos de lavado de tubos. ▪ Agitador magnético para disolver medios de cultivo. ▪ Magentas de vidrio. ▪ Tubos de ensayo.
29
▪ Botellas con t apa rosca. ▪ Refrigerador. ▪ pH - metro. ▪ Autoclave de presión para la esterilización a vapor. ▪ Camara de flujo laminar. ▪ Mechero bunsen para flamear las pinzas y bisturís. ▪ Pinzas de puntas finas para la sujecciòn de los tejidos en el corte con
el
bisturí. ▪ Bisturís para el corte del tejido. ▪ Agujas finas para separas meristemas. ▪ Microscopio binocular.
9.2. LAVADO DE MATERIALES DE VIDRIO Y PLASTICO DEL LABORATORIO. MATERIALES. Para realizar el lavado de los materiales de vidrio en el laboratorio debemos contar con detergente, jabón, rascabuches o cepillo de tubos de ensayo, agua, etc.
PROCEDIMIENTO. El lavado de los materiales se realizó usando la esponja con jabón o detergente, siendo necesaria la utilización de una corriente de agua y un balde para el enjuague. Se lavaron los materiales de vidrio, las Magentas, Tubos de ensayo, Vasos de precipitación, Erlenmeyer, etc.
9.3. ASEPSIA DEL LABORATORIO MATERIALES ▪ Hipoclorito de sod io ▪ Alcohol ▪ Algodón. ▪ Detergente y jabón. ▪ Agua. ▪ Etc.
30
En el laboratorio de cultivos In vitro, la asepsia es muy importante y se realizó de la siguiente manera:
PROCEDIMIENTO Se realizo una limpieza general de las salas de esterilización, sala de micropropagacion y sala de crecimiento, con el uso del detergente en agua, jabón en agua, y el uso final de hipoclorito de sodio. Se realizó la limpieza de las repisas, pisos, ventanas, estantes, etc. La importancia de este método radica en que: ▪ Una buena asepsia conlleva al éxito del crecimiento de las plántulas. ▪ La asepsia reside principalmente en mantener el ambiente
libre de
microorganismos patogenos. ▪ Al ingresar
al laboratorio se debe de usar guardapolvo para así evitar que
contaminemos el medio o la sala. ▪ La limpieza de mesas y repisas se realiza utilizando algodón empapado con
alcohol e hipoclorito de sodio para así dejar el medio libre de contaminantes en la repisa.
9.4. ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO, PLACAS PETRI, MAGENTAS, PINZAS, BISTURI, AGUA. La esterilización tanto del material de vidrio, material de plástico y medios de cultivo es un proceso esencial en todo laboratorio de cultivo In vitro.
MATERIALES Autoclave.
PROCEDIMIENTO Los materiales se ponen dentro del autoclave en bolsas de polipropileno y dejamos que se incremente la temperatura hasta llegar a los 300 grados centígrados durante 15 min. Esta olla autoclave cuenta con un termostato 31
que regulara la temperatura y un reloj que indicara la presión a la que se encuentra en el interior.
EL AUTOCLAVE Es un instrumento habitual en los laboratorios, En esencia el autoclave es un recipiente en el cual se consigue exponer a los materiales a una alta temperatura, superiores a la de la ebullición del agua gracias al aumento de la presión. Debemos recordar que para la esterilización debemos de mantener un nivel con agua destilada dentro del autoclave antes de llenar los materiales y medios de esterilización y luego asegurar el equipo para no dejar salir el vapor de agua. Siendo esta práctica necesaria solo cuando la temperatura sobrepasa la adecuada. Entonces haremos necesaria la utilización de la válvula del purgado.
FUNCIONAMIENTO FASE DE PURGADO: A medida que la energía calienta el agua del fondo del carderìn, se va produciendo vapor que desplaza el aire, haciendo salir por la válvula de purgado este vapor caliente. Esta fase termina cuando alcanza la temperatura adecuada de esterilización,
FASE DE ESTERILIZACION: Una ves cerrada la válvula de purgado y alcanzada la temperatura adecuada se inicia el proceso de esterilización,
FASE DE DESCARGA: Llegado la temperatura de esterilización controlamos 15 minutos para luego apagar el autoclave. Dejamos durante dos horas para luego abrir la tapa y sacar todo el material del recipiente autoclave y llevarlos al cuarto de micropropagacion.
9.5. ASEPSIA DE LA CAMARA DE FLUJO LAMINAR MATERIALES Buena parte de las manipulaciones propias del cultivo In vitro debe realizarse en condiciones de esterilidad total para así evitar la contaminación 32
de los materiales propagadas. Y para evitar esto haremos uso de la cámara de flujo laminar.
PROCEDIMIENTO La esterilidad de la cámara de flujo laminar se consigue por que circula en su interior, aire puro y no deja ingresar aire de afuera de la cámara, para la total esterilización se logro con una desinfección previa con papel toalla empapada con alcohol.
9.6. DESTILACION DE AGUA MATERIALES ▪ Destilador de agua.
PROCEDIMIENTO La destilación del agua se lleva a cabo gracias a un destilador de agua que viene equipado con todo lo necesario que calienta el agua contaminada y deja salir solo el vapor de agua libre de todo contaminante. Que al pasar por al destilador se enfria y deja caer gotas de agua destilada a un frasco definitivo.
9.7. MICROPROPAGACION DE PAPA MATERIALES ▪ Placas petri esterilizadas. ▪ Bisturís. ▪ Pinzas, ▪ Cámara de flujo laminar ▪ Magentas con plantitas
de papa en crecimiento
▪ Materiales de desinfección.
33
PROCEDIMIENTO DE MICROPROPAGACION
Esterilizar placas Petri (colocadas en bolsas) y preparar la cámara de flojo laminar desinfectando con alcohol las superficies internas. Esterilizar los instrumentos con la ayuda del mechero y colocarlos sobre una placa Petri.
Destapar la magenta, extraer la planta y colocarla sobre la placa Petri con la ayuda de una pinza y el bisturí.
Extraer las hojas y cortar los nudos.
Destapar una magenta con medio fresco esteril y colocar los nudos en su interior, tratando de hundirlo ligeramente en el medio y con la yema hacia arriba. Tapar el frasco.
Sellar la magenta con cintas plásticas y rotularlo correctamente.
trasladar los frascos a la sala de de incubación.
Siguiendo los mismos pasos se micropropagó 1200 plantas de papa entre las variendades Qeqorani, Yanasuytu, Qachunwaqachi, Amarillo Tumbay, Moro Huayro, Camotillo y Duraznillo.
Esquema del proceso de la micropropagacion de plántulas de papa.
34
9.8. EVALUACION VISUAL DE CONTAMINACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y PLANTAS IN VITRO MATERIALES ▪ Papel ▪ Lapicero
PROCEDIMIENTO Con la ayuda visula se realizó la evaluación de los medios y plántulas de papa micropropagadas, encontrándose muy pocos magentas contaminados pero un alto porcentaje de magentas con plántulas sanas y con crecimiento rápido de las yemas.
35
10. RESULTADOS.
Se propago 1200 plantulas de papas nativas entre las variedades
(qeqorani, yanasuytu, qachunwaqachi, amarillo tumbay, moro huayro, camotillo, duraznillo), que servirá como material biológico para la conservación y propagación de estas variedades, que se muestran en el cuadro con sus cantidades correspondientes.
VARIEDADES
Qeqorani Yanasuytu Qachunwaqachi Amarillo tumbay Morohuayro Camotillo Duraznillo Total
CANTIDADES MICROPROPAGADAS 200 plantulas 250 plantulas 200 plantulas 100 plantulas 300 plantulas 100 plantulas 50 plantulas 1200 plantulas
se logro mantener en optimas condiciones de asepsia tanto el ambiente del laboratorio como de los equipos y materiales, para lo cual se realizaba la desinfección y/o esterilización inmediatamente después de su uso.
36
11. CONCLUSIONES.
Las prácticas realizadas en el laboratorio de Biotecnología de la UTEA, me permitieron reforzar conocimientos, habilidades y destrezas en el manejo de equipos, instrumentos y principalmente conocer y aplicar métodos de micropropagacion in vitro de papas nativas que servirán como material de conservación y propagación de las diferentes variedades micropropagadas.
El cultivo in vitro es una tecnología que nos brinda muchas oportunidades en la micropropagación de plantas, en especial en producir plantas madres optimas para su propagación, ya que cuenta con un control estricto para su propagación.
37
12. RECOMENDACIONES.
Se recomienda a los alumnos de Agronomía realizar prácticas en el Laboratorio de Biotecnología de la UTEA, ya que es importante tener una visión integral de la carrera para llegar a ser mejores profesionales.
La UTEA debiera destinar un mayor presupuesto al Laboratorio de Biotecnologia ya que es fundamental ampliar el laboratorio e implementarlo con el material necesario para poder recibir mayor cantidad de alumnos de todas las carreras.
38
13. BIBLIOGRAFIA. 1. Albarracín, H. 2008. Módulo de Trabajo Métodos Biotecnológicos. UNIVERSIDAD PRIVADA JOSE CARLOS MARIATEGUI, Moquegua-Perú. 73 pp. 2. Alvarez, M. y Repo, C., 1999. Desarrollo de Productos de Papas Nativas. Centro Internacional de la Papa. Lima, Perú. 3. García Noguera, N. (2002), Biotecnología. Especialista Derecho Nuevas Tecnologías. 4. Gonzales C. y Vilca J. 1998. Micropropación Vegetativa In Vitro De Aliso ( Alnus acuminata). Edición Graficas de ADEFOR. Cajamarca – Perú. Páginas 6-13.
5. Haddad O. (1994). CIEN BTA-03: a new somaclonal variant resistant to yellow sigatoka. Biochemical, genetic and molecular characterization and agronomic studies. INFOMUSA, Vol 10: 12-13. 6. Harris, P. M., ed 1978. El cultivo de la papa. Londres: Chapmam y Hall. 7. Hawkes, J. G., 1990 La papa: Evolución, la biodiversidad y los recursos genéticos. Belhaven Press, Oxford, Inglaterra / Smithsonian Institution Press, Washington, DC 259 pp 8. Hurtado, M. D. V. y Merino, M. 1994. Cultivo de Tejidos Vegetales. 3° reimpresión 232 p. Editorial Trillas. Mexico, Argentina, España, Colombia, Puerto Rico, Venezuela. 9. Jiménez-Gonzalez, A. E., 1998a. generalidades del cultivo invitro. In: Peréz Ponce, JN. (Ed.) Propagación y Mejora genética de plantas por biotecnología. Instituto de Biotecnología de las Plantas, Cuba. 12-42 pp. 10. Jiménez-Gonzalez, AE. 1998b. Cultivo de Ápices y Meristemos. In: Peréz Ponce, JN. (Ed.) Propagación y Mejora genética de plantas por biotecnología. Instituto de Biotecnología de las Plantas, Cuba. 45-65 pp. 11. Liu, M. C. 1981. In vitro methods applied to sugar cane improvement. In plant tissue culture methods and application in agriculture. Ed. By T. A. Thorpe. New York. Academic Press. P. 299-323. 39
12. Mejía, R. y Vittorelli, C. 1988. Manual de Laboratorio - Cultivo in vitro. INIAA (Sector Agrario). 13. Muñoz, S. 2003. Embriogénesis somática en cedro (Cedrela odorata Linnaeus) a partir de cotiledones. Tesis de pre-grado, Universidad Nacional Agraria La Molina, Facultad de Ciencias, La Molina, departamento de Lima, Perú. 111 pp. 14. Radice, Silva (2004) Morfogénesis in vitro. Parte II Herramientas Básicas de la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. En: Echenique, V; Rubinstein C y Mroginski L (eds.). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. (Ed): INTA, Buenos Aires, Argentina, pp. 27 - 33. 15. Thorpe, T. A (1995) In vitro embryogenesis in plants. (Ed): Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, 558 pp. 16. Villalobos, V y Thorpe T (1991) Micropropagación: conceptos, metodologías y resultados. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. (Ed): Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia, pp. 128 - 141. 17. www.peru ecologico.com.pe/tub_ papa .htm 2012.
40
14. ANEXOS. FOTOGRAFIAS. LABORES REALIZADAS EN EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA. Fot. 01 Extraccion de plántulas de la magenta a la placa Petri para su diseccion.
Fot. 02. diseccion de nudos e introducción en el medio de cultivo solido.
41
Fot. 03. Introducción de nudos al medio de cultivo.
Fot. 04 y 05. Evaluación de los cultivos in vitro de papa
42
