Tehnici Cromatografice

Cercetarea criminalistică a microurmelor

8 Tehnici cromatografice............................ cromatografice................................................... .............................................. .............................................. ............................................1 .....................1 8.1 Cromatografia în strat subţire (thin layer chromatography, TLC)................................... TLC)............................................. ..........44 8.1.1 !orbenţi folosiţi în TLC.......................................................... TLC................................................................................. ..........................................4 ...................4 8.1." #ecanismul separ$rii.................................. separ$rii......................................................... .............................................. .............................................. ...........................% ....% 8.1.& Cromatopl$ci pentru tehnica TLC 'i aplicarea probelor.................................................... probelor.....................................................8 .8 8.1.4 e*oltarea cromatogramei 'i !etecţia (localiarea) analiţilor pe cromatoplac$................+ 8.1. Caracteristici ale cromatopl$cilor !in TLC.................................................. TLC................................................................ .....................1.......18.1..1 actorul !e ratar!are (retenţie, /f)....................................................... /f)....................................................................... ......................1......18.1.." actorul !e capacitate.............................. capacitate..................................................... .............................................. .......................................... .....................1..18.1..& 0n$lţimea unui taler cromatografic............................................................................. cromatografic.............................................................................11 11 8.1.% plicaţii ale cromatografiei în strat subţire.............................................. subţire....................................................................... .........................11 11 8." Cromatografia ionic$ (C).............................................. (C)..................................................................... .................................................. ................................... ........1" 1" 8.".1 2chimb$torii !e ioni........................................... ioni.................................................................. ...................................................... ........................................ .........1" 1" 8."." 3recursori polimerici ai r$'inilor schimb$toare !e ioni.....................................................1& ioni.....................................................1& 8.".& #ecanisme !e separare............................... separare...................................................... .............................................. ................................................1& .........................1& 8.".4 Con!uctometria Con!uctometria  mi5loc mo!ern !e !etecţie în cromatografia ionic$..............................1 8.".4.1 3rincipiul !etectorilor con!uctometrici !e supresie.............................. supresie................................................. .....................1 ..1 8.".4." 2upresorul electrochimic................................. electrochimic........................................................ ...........................................................1% ....................................1% 8.".4.& uncţionarea autosupresorului în analia anionilor....................................................1+ anionilor....................................................1+ 8.".4.4 uncţionarea autosupresorului în analia cationilor............................................ cationilor....................................................... ...........""8.& Cromatografia !e lichi!e...................................... lichi!e............................................................. .............................................. ....................................... ......................"1 ......"1 8.&.1 Cromatografia !e lichi!e pe coloan$ clasic$ (CL)............................................................ "1 8.&." Cromatografia !e lichi!e pe coloan$ instrumental$.............................................................. instrumental$.............................................................."1 "1 8.&.& Clasificare................................. Clasificare........................................................ .............................................. .............................................. ..........................................."" ...................."" 8.&.4 paratura utiliat$ în cromatografia !e lichi!e........................................ lichi!e................................................................. ........................."& "& 8.&. ae mobile 'i staţionare, polaritate......................................... polaritate.................................................................................."4 ........................................."4 8.4 Cromatografia !e gae.................................. gae......................................................... .............................................. .............................................. .............................." ......." 8.4.1 specte teoretice.................................................... teoretice........................................................................... ............................................. .................................... .............." " 8.4." 2istemul ga cromatografic............................... cromatografic...................................................... ................................................................"% ........................................."% 8.4.& aa mobil$ folosit$ în cromatografia !e ga................................... ga.......................................................... ................................."6 .........."6 8.4.4 ae staţionare folosit$ în cromatografia !e ga...................................... ga........................................................... ........................."6 ...."6 8.4. etectori folosiţi în cromatografia !e ga..................................... ga........................................................................."+ ...................................."+ 8.4.% plicaţii ale cromatografiei !e ga.................................... ga........................................................... ................................................"+ ........................."+ 8 Tehnici cromatografice Chimia reprezintă instrumentul major folosit în investigarea sistemelor chimice. Prin mijloacele mijloacele sale va permi permite te obţin obţinere ereaa inform informaţi aţiililor or refer referito itoare are la mater materie, ie, incluz incluzân ândd compo compoziţ ziţia, ia, struct structura ura,, proprietăţile fizice şi reactivitatea acesteia. epararea amestecurilor !comple"e# în componente este aplicată în toate domeniile chimiei, precum şi în ştiinţele înrudite cu aceasta. $n prezent tehnicile moderne de separare, cum ar fi cromatografia şi electroforeza, sunt folosite în domenii în care principalii compuşi studiaţi sunt de natură !bio#organică, cromatografia fiind folosită mai ales în chimia organică, iar electroforeza în biochimie biochimie şi biotehnologie. biotehnologie. epararea eficientă a compuşilor chimici similari este posibilă doar prin folosirea unor paşi repetaţi de separare şi care, în acord cu distribuţia distribuţia lui Craig, Craig, sunt potriviţi în termeni termeni practici numai numai pentru etapele etapele preparative. preparative. %otanistu %otanistull rus &i'hail &i'hail emanovi emanovich ch (s)ett (s)ett este conside considerat rat *părintel *părintele+ e+ cromatog cromatografi rafiei, ei, prin prin studiul fenomenului de absorbţie în coloane cu umplutură, dezvoltat în jurul anilor -. /a acea perioadă, folosind o coloană împachetată, cercetătorul a reuşit să separe e"tracte din pigmenţii frunzelor, precum clorofila şi "antofil spirilo"antina. $ntr0o lucrare scrisă în limba rusă, cercetătorul /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU

2otiţe curs 03 


descrie paşii e"perimentali parcurşi la separarea *carotenului+ !zonă galben roşie#, a "antofilului !zonă galbenă# !carotinoida o"igenată la C 4# şi a clorofilului !zonă verde# pe o coloană umplută cu inulină !C56780637, o polizaharidă solubilă, alcătuită din grupări fructoză, ce apare în diferite plante ca rezervă de hrană#, folosind ligroin ca solvent !un amestec de hidrocarburi cu p.f. 903 :C#. 7bservarea unor zone colorate pe coloană l0a condus pe cercetătorul rus la ideea de a denumi tehnica dezvoltată prin cuvântul cromatografie !grecescul *chroma+ pentru culoare şi *graph *graphei ein+ n+ pentr pentruu scrie scriere# re#.. $n -5, -5, (s)ett (s)ett a prezen prezentat tat o descri descriere ere amănun amănunţit ţităă a metod metodei ei cromatografice dar ceea ce a uimit ulterior cercetătorii din domeniul cromatografie a fost, ;n special, contrastul între simplitatea aparaturii folosite şi rezultatele obţinute. uhn !laureat al premiului 2obel în -=?# şi /ederer au separat în scop preparativ carotenul din morcovi !morcovi roşii# în două hidrocarburi alfa şi beta caroten !C 4685#, prin absorbţie pe coloane umplută cu o"id de aluminiu. @proape în aceeaşi perioadă, Ainterstein a separat pe o coloană cu umplutură de CaC7 = !cu diametru de 9 cm# două "antofile, viola"antina !pigment "antofilic de culoare portocalie care protejează plantele de eventualele distrugeri foto0 o"idative# şi luteina !carotenoid natural cu acţiune antio"idantă#. antio"idantă#. $n orice caz, istoric vorbind, evoluţiile înregistrate în domeniul cromatografiei pot fi enumerate după cum urmeazăB -= (s)ettB enomenul de adsorbţie în coloană cu umplutură -= >uhn, /ederer Ainterstein A intersteinBB Primele separări semnificative din punct de vedere preparativ -=9 (iseliusB Dlectroforeza soluţiilor libere într0un tub -=? Ezmailov, hraibeeB Cromatografia în strat subţire !thin laFer chromatographF, (/C# -4 &artin, FngeB Cromatografia de repartiţie !liGuid chromatographF, chromatographF, /C# -44 Consden, Hordon, &artinB Cromatografia pe hârtie !planar chromatographF, chromatographF, PC# -4? (iseliusB Dlectroforeza -4- pedding, (omp'insB Cromatografie de schimb ionic !ionic e"change chromatographF, chromatographF, EDC# -83 Iames, &artinB Cromatografia de gaze !gas chromatographF, HC# -89 HalaFB Cromatografia de gaze cu coloane capilare !capilar gaz chromatographF, chromatographF, CHC# -8- Parath, ladinB Hel cromatografia 0 gel filtrarea -55 PielB Cromatografia de lichide de înaltă performanţă !high performance !pressure# liGuid chromatographF, chromatographF, 6P/C# -5- >lesperB Cromatografia de fluide supercritice !supercritical fluid chromatographF, C# -? 2a'aga)aB Cromatografia electrocinetică %azele teoretice riguroase şi progresul înregistrat în domeniul electronicii au permis elaborarea unor procedee de înaltă performanţă în instalaţii automate de reglare, măsurare, înregistrare a semna semnalel lelor or şi preluc prelucrar raree a datel datelor or iar iar în tehni tehnica ca croma cromatog tograf rafică ică,, aceste aceste evoluţ evoluţiiii au permi permiss îndeplinirea îndeplinirea unei mai veche dorinţe a chimiştilor analişti, aceea de a realiza un aparat care să permită o programare în urma căreia după introducerea probei de analizat, aparatul să furnizeze /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU

2otiţe curs 03 3


într0un timp foarte scurt scurt rezultatul e"act e"act al întregii analize. analize. Cromatografia include o variată şi importantă grupă de metode ce permit separarea unor compuşi asemănători din amestecuri comple"e. Cromatografia a evoluat progresiv de la o metoda de separare şi purificare de laborator la o tehnica de separare şi analiza chimică cu o arie de apli aplica care re univ univer ersa sală lă.. @nal @naliz izaa chim chimic icăă crom cromat atog ogra rafifică că este este un dome domeni niuu rece recent nt al anal analiz izei ei instrumentale care include metode de separare şi analiză a componenţilor unui amestec comple" dintr0o probă. $n toate variantele, separarea precede analiza şi se realizează prin repetarea, de un număr mare de ori, a echilibrului de distribuţie între o faza staţionară !aflată de obicei într0un tub numit coloană# şi o faza mobilă care se deplasează prin golurile primei faze. Principiul cromatografiei cromatografiei se bazează pe trecerea constituienţilor constituienţilor de separat prin cele două faze nemiscibile, faza staţionară şi faza mobilă. Pentru aceasta proba este dizolvată în faza mobilă, care poate fi un lichid, gaz sau fază supercritică, şi ulterior transportată de0a lungul fazei staţionare care poate fi într0o coloană sau pe o suprafaţă solidă. uncţie de felul în care se dezvoltă cromatograma se face distincţie între cromatogramele interne şi cromatogramele e"terne. $n cromatogramele interne diferiţi constituenţi ai probei se deplasează pe distanţe diferite în acelaşi interval de timp iar la sfârşitul separării aceştia încă se află în stratul de separare ceea ce înseamnă că, de fapt, aceştia sunt detectaţi direct în stratul de separare. @cest tip de cromatografie este folosit în tehnicile planare precum cromatografia pe hârtie şi cromatografia în strat subţire. $n aceste situaţii faza staţionară este situată pe un suport planar şi faza mobilă se deplasează de0a lungul fazei staţionare prin forţe capilare sau prin influenţa gravitaţiei. Cromatogramele e"terne se obţin în cromatografia pe coloană. $n acest caz toţi constituenţii traversează aceeaşi rută prin stratul de separare şi, datorită interacţiilor specifice cu faza staţionară, apar la sfârşitul coloanei la timpi diferiţi. aza mobilă, denumită şi eluent, poate provoca migrarea cu viteze diferite a unui număr mare de componenţi ai unui amestec de separat de0a lungul coloanei. @mestecul supus separării poate fi introdus sub formă de soluţie la începutul coloanei, folosindu0se un dispozitiv de introducere a probei !de e"emplu o micro0seringă#, şi se află iniţial fi"at într0o zonă îngustă de la începutul coloanei. pălaţi de eluent, o parte din componenţii probei migrează apoi prin coloană cu viteze diferite. @cest lucru se datorează interacţiunilor interacţiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei şi faza staţionară !nu orice moleculă poate migra pe orice fază staţionară#. Dfectul, este numit retenţie şi aceasta provoacă o aşa0numită migrare diferenţiată când moleculele migrează în grupuri, în fiecare grup e"istând doar molecule de acelaşi fel. @ceasta face posibilă sesizarea componenţilor, pe rând, la părăs părăsire ireaa coloa coloanei nei,, de către către un instru instrumen ment,t, în grupur grupurililee respec respectiv tivee 0 denum denumite ite uneor uneorii zone. zone. Enstrumentul amintit este un analizor fizico0chimic, sensibil la mai mulţi !în mod ideal la oricare# dintre componenţii ce ies din coloană şi care este plasat în eluent, imediat după ieşirea din coloană. @cest analizor, denumit detector este capabil să dea un semnal proporţional cu masa sau cu concentraţia soluţiei de component în faza mobilă. 1ispozitivul sesizează trecerea fiecăreia din /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU

2otiţe curs 03 =


substanţele ce formează iniţial proba iar prin reprezentarea grafică a semnalului detectorului în funcţie de timp se va obţine cromatograma.

8.1 Cromatografia n strat su!"ire #thin la$er chromatogra%h$& TLC' @cest tip de cromatografie are drept scop separarea şi concentrarea cantităţilor mici de substanţă din amestecuri comple"e. %azele tehniciii (/C au fost puse de Ezmailov şi chreider !-=-# care au folosit e"tracte de plante medicinale, iar ca suport @l 37=. Jece ani mai târziu &ainhard şi 6all au folosit această tehnică pentru separarea unor ioni anorganici folosind ca adsorbant alumina, ca liant amidonul iar ca suport solid lamele de microscop. &ai târziu >elles !-8# foloseşte ca suport silicagelul, iar ca liant ipsosul. Cromatografia în strat subţire este mai rapidă, are o rezoluţie mai bună şi este mai sensibilă decât cromatografia pe hârtie. $n termeni teoretici, tipurile de faze staţionare şi mobile, aplicaţiile cromatografiei pe hârtie şi cromatografiei în strat subţire sunt aproape identice. (ehnica (/C adeseori este folosită ca mijloc de determinare a condiţiilor optime pentru efectuarea separărilor prin tehnica cromatografiei de lichide pe coloană. @vantajele utilizării acestei tehnici sunt constituite din viteza mare şi costurile scăzute pentru efectuarea unor e"perimente e"ploratorii.
ă nu reacţioneze cu substanţa de separat, cu solvenţii sau cu reactivii folosiţi pentru vizualizarea spoturilor.



ă fie rezistenţi la temperaturi înalte.



ă aibă o suprafţă activă şi specifică.

ă aibă o granulaţie cât mai fină şi un număr mare de pori cu diametru mic şi controlat !de aceeaşi dimensiune#. Cu cât dimensiunea porilor este mai mică cu atât viteza de deplasare este mai mică. Ca adsorbenţi se folosesc geluri de silice cum ar fi silicagel H care este un silicagel cu liant !ipsos#, silicagel cu indicator de fluorescenţă, adsorbenţi anorganici de tipul aluminei !@l 37=#. @lumina, funcţie de modul de preparare şi activare se poate găsi în formeleB 

a)

γ care

este o formă activă utilizată în (/C

b)

α care

este o formă compactă, reactivă care se obţine din γ alumină încălzită la  oC.

/ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU



0a studiat structura poroasă a @l 37= şi s0a constatat că posedă un sistem regulat de micropori cilindrici cu diametru de 3,9 LM la care se adaugă micropori neregulaţi cu diametru normal mai mare. @l37= conţine cantităţi diferite de apă fie sub formă grupelor 76 superficiale sau ca apă adsorbită. 0a presupus că interacţiile la suprafaţa aluminei sunt în general de natura electrostatică. Centrele active de pe suprafaţa aluminei sunt centre acide, bazice sau cu transfer de sarcină. 1upă natura grupărlor funcţionale superficiale pe care le prezintă alumina e"istă trei tipuri de fază staţionarăB 76

76

@l

7

a# @lumină acidă

@l 7

@l 0 N 7 2a @l

7

7

b# @lumină neutră obţinută prin dehidro"ilare

@l 0 N 7 2a

c# @lumină bazică

@l

@ctivitatea de adsorbţie a aluminei poate fi controlată prin modificarea conţinutului de apă. Prin încălzire la =5 oC timp de 8 h alumina este total lipsită de apă !gradul E de acţionare e"primat în procente de O#. 6itratând aceasta la diverse temperaturi şi cu un anumit conţinut de apă se poate obţine alumină grad EE !=O grade de activiFtate#, alumină grad EEE !5O#, grad E !O# şi grad  !8O#. ilicagelul e adsorbentul cu cea mai largă utilizare. Dste produsul de policondensare a cidului orto0silicic. Pe suprafaţa silicagelului în afara grupelor silanolice tip 76 se pot forma şi alte grupări, prin dehidro"ilare. 76 76 legături silo"anice obţinute prin a# 7 i

i

i

7 6

dehidro"ilarea unei anumite cantităţi din aceste grupări. grupe silanolice hidratate ce pot apare b# într0o anumită proporţie chiar după uscare. e preferă această formă pentru compuşii polari deoarece are suprafaţă de contact mare.

i 7

6 7

6

6

7

7

i

i 7 i C6=

i 76

7

i

N 6=C

76

i C6=

N

0 7 N6

i

76

C6= 6 2

i

7

i

i

7 C6 =

7

7

i

i

i

C6=

C6= 6=C

Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU

i 7

i 6=C

C6=

C6= 6=C C6=

/ector 1r. Cecilia ARSENE

7


C6=

Cercetarea criminalistică a microurmelor Hrupările silanolice se pot manifesta şi ca schimbători de ioni. Constanta de disociere, >Q , comparativă cu a fenolilor. Pentru remedierea acestor deficienţe s0au propus mai multe metode dintre care blocarea centrilor de adsorbţie cu Pd sau @g, adsorbţia continuă a unor compuşi puernic adsorbabili care să reducă dispersia fără a afecta selectivitatea, silanizarea suprafeţelor !tratarea cu he"ametilen disilo"an sau dimetil diclor silan#. 6 i

7

7

i

7

i

i

7

i

c#

i

6 6 i

7

7

i

la temperaturi mai mari de 4 oC se poate produce o sintetizare a particulelor adiacente conducând la micşorarea suprafeţei specifice.

6

Pe lângă modificarea polarităţii se poate modifica şi suprafaţa specifică. iteza de distribuţie va fi lentă.
b# Cu miez compact cu suprafaţă cu porozitate controlată. Conferă o suprafaţă de contact mai mare, o sensibilitate şi selectivitate mai mari.

8.1.) *ecanismul se%arării &ecanismul separării prin (/C se bazează în principiu pe distribuirea componenţilor unui amestec comple" între două faze dintre care o fază staţionară !f s# solidă sau lichidă şi alta o fază mobilă !f m# care străbate faza staţionară. uncţie de natura fazei staţionare se întâlnescB 

(/C de adsorbţie !faza staţionară  şi faza mobilă /#



(/C de repartiţie !faza staţionară / şi faza mobilă /#



(/C de schimb ionic.




Componenţii amestecului sunt antrenaţi de faza mobilă şi trecuţi peste faza staţionară. iteza de migrare va fi diferită şi va depinde de modul în care componenţii se distribuie în cele două faze !viteza de migrare a componentului sau eluentului#. 1acă unul din componenţii amestecului este mai puternic adsorbit de faza staţionară el va rămâne mai mult timp mobilizat în această fază, deci va rămâne mult în urma frontului de solvent. 1acă componentul migrează mai repede acest comportament este un indiciu că moleculele lui sunt mai strâns legate de faza mobilă şi la echilibru aceasta conţine un număr mai mare din moleculele solutului decât faza staţionară.
C&

@ %

C @ @ %

%

+igura 8.1.aB Ezoterme de distribuţie liniare ideale.

Concentratia in faza mobila !C &#

C&

@ %

C

@

@ %

%

+igura 8.1.!B Ezoterme de distribuţie neliniare neideale !fenomene însoţite di difuzia zonelor#.


C&

@

@ %

C @ %

%

+igura 8.1.cB Ezoterme de distribuţie neliniare neideale !fenomene însoţite di difuzia zonelor#.





(ratarea riguros matematică a acestor procese nu e posibilă dacă pe lângă procesul de repartiţie0adsorbţie are loc procesul secundar de transport de masă, difuziune, adsorbţie0desorbţie, fenomene care se influenţează şi se condiţionează reciproc. a# izoterma liniară idealăB este o linie dreaptă mai mult sau mai puţin înclinată, după cum componentul mai mult sau mai puţin reţinut de faza staţionară. Dchilibrul se stabileşte instantaneu, fenomenul de difuzie lipseşte iar forma zonelor de separare a celor doi componenţi e perfect determinată şi simetrică. Concentraţia componenţilor substanţelor în interiorul fiecărei zone e repartizată uniform. b# izoterma adsorbţiei neideale este apro"imativ liniară. Dchilibru de adsorbţie se stabileşte relativ încet. ubstanţele difuzează şi ca atare petele cromatografice au margini difuze. Uepartizarea substanţelor în interiorul petei e neuniformă. c# izoterme curbe concave sau conve"eB substanţele diferă mult, petele apar cu cozi şi e"istă condiţii necorespunzătoare pentru separare. Pot apare aceste situaţii din cauza faptului că adsorbanţii sau solvenţii de migrare nu au fost bine aleşi sau datorită faptului ca nivelul concentraţiilor celor două substanţe e mult prea mare şi depăşeşte capacitatea de adsorbţie a fazei staţionare. Uepartizarea componenţilor de0a lungul cromatogramei se face funcţie de solubilitatea solutului în cele două faze lichide şi va depinde de o serie de factori structurali şi polaritate. aza mobilă dă legături intermoleculare !legături de hidrogen# dacă în cealaltă fază e"istă substanţe care conţine grupări capabile să formeze astfel de legături !grupări 76#. D"emple de adsorbenţi ce posedă aceste legături includ silicagelul şi alumina !valorile U f cresc odată cu creşterea tăriei legăturii de hidrogen între substanţă şi solvent şi valorile U f scad odată cu creşterea energiei legăturii de hidrogen între substanţe şi adsorbent #. &ai pot apare legături polare, multipolare, legături donor0acceptor.

8.1., Cromato%lăci %entru tehnica TLC -i a%licarea %ro!elor (ehnica (/C constă în obţinerea unui strat subţire de adsorbent pe o placă de sticlă sau alt suport. 1imensiunile sunt diferite. Plăcile pot fi şi achiziţionate. &ărimile acestor plăci variază de la 8V3, V3 şi 3V3. Plăcile comerciale pot fi convenţionale şi de înaltă performanţă. /a plăcile convenţionale grosimea stratului este de 3 T 38 Lm cu dimensiuni ale particulelor de 3 µm. /a plăcile de înaltă performanţă grosimea stratului este de  Lm cu dimensiuni ale particulelor de 8 µm

sau chiar mai mici. Cromatoplăcile de înaltă performanţă dau separări mai bune în timp mai

scurt. 7 placă convenţională poate da până la 3 talere pe o distanţă de 3 cm într0un timp de 38 minute. Pentru cromatoplăcile de înaltă performanţă se pot obţine până la 4 talere pe o distanţă de = cm într0un timp de până la  minute. 1ezavantajul cromatoplăcilor de înaltă performanţă suferă de dezavantajul de a avea capacităţi reduse ale probelor. @plicarea probelor în tehnica (/C este cel mai critic aspect. Pe cromatoplăci se trasează o linie de start imaginară la circa 3 cm de unul din capete. oluţia de analizat !de concentraţie , T ,O# se aplică cu o micropipetă ! T  Ll sau  0  Lg#. 1iametrul petei aplicate nu trebuie să /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU

2otiţe curs 03 ?


depăşească = mm în diametru !pentru a obţine eficienţa cea mai bună la separare#. Pentru depunerea succesivă a unei soluţii diluate este necesară uscarea petei de fiecare dată, pentru a obţine zone înguste concentrate. @plicarea manuală se realizează prin folosirea unei capilare sau a unei seringi hipodermice. D"istă şi sisteme automate care cresc precizia şi acurateţea la aplicarea probei !'oog#. olosirea capilarelor din platină0iridiu permite aplicarea unor spoturi cu volume de  T 3 n/ !>ellner#.

8.1. /e0oltarea cromatogramei -i (etec"ia #locali0area' anali"ilor %e cromato%lacă Pentru separări se folosesc cromatoplaci activate. @ctivarea cromatoplăcilor se face înainte de utilizare prin introducerea în etuvă la o temperatură în jur de   C, timp de 48 minute T  oră. 1upă pregătirea probelor placa se usucă şi se supune migrării în camere cromatografice speciale, închise etanş. /inia de start de pe placă trebuie să fie cu cel puţin ,98 T  cm deasupra nivelului lichidului din camera cromatografică închisă etanş şi saturată în vapori în mediul de deasupra solventului. e lasă să se irige placa !frontul solventului să ajungă la 3 cm de partea superioară#, se îndepărtează cromatoplaca din camera cromatografică, se usucă şi se identifică substanţele separate. Pentru localizarea spoturilor !vizualizare# după realizarea separării se pot folosi atât reactivi anorganici cât şi organici. &etodele cel mai des aplicate implică spraF0ere cu o soluţie de iod sau acid sulfuric, ambele reacţionând cu o serie de compuşi organici. e poate folosi şi ninhidrina. 7 altă metodă de detecţie constă în încorporarea unui material fluorescent în faza staţionară. 1upă dezvoltarea cromatogramei, cromatoplaca se e"aminează sub lumină <. Componenţii probei atenuează fluorescenţa astfel că toată cromatoplaca are fluorescenţă cu e"cepţia spoturilor unde e"istă analiţii separaţi. &etodele de localizare a spoturilor pot fi sistematizate în orice caz după cum urmeazăB a# folosirea caracteristicilor de luminiscenţă a analitului !fenomenul de fluorescenţă pentru compuşi organici şi fenomenul de fosforescenţă pentru compuşi anorganici# b# impregnarea stratului fazei staţionare cu o substanţă indicatoare fluorescentă !ca substanţe indicatori se pot folosi derivaţii de piren, fluoresceina, morina sau rodamina %# c# spraF0ere cu un o"idant pouternic nespecific !627 =, >&n74, 6374#. @par spoturi negre la o"idarea compFşilor organici d# spraF0ere cu soluţii de reactivi specifici !ninhidrina pentru a vizualiza gruparea 26 3 !+igura 8.)#, clorura de e!EEE# pentru fenoli, ftalatul de anilină pentru zaharurile reducătoare, sau reactivi de formare a complecşilor pentru vizualizarea ionilor metalici. 7

7

7

C

C

76 C

C

U0263

76

C C 7

7 ninhidrina


+igura 8.)B ormarea produsului colorat în albastru din reacţia dintre ninhidrină şi grupările 263.

2

7

produs albastru colorat

2otiţe curs 03 -


8.1.2 Caracteristici ale cromato%lăcilor (in TLC 8.1.2.1 +actorul (e ratar(are #reten"ie& R f ' actorul de retardare, U f se determină prin raportul dintre distanţa parcursă de analit de la linia de bază şi distanţa parcursă de solvent de la linia de bază. U f

=

dU d&

1eoarece spoturile nu sunt simetrice, distanţa se măsoară până la poziţia de intensitate ma"imă !+igura 8.,#. d& dU

Proba 3 Uf W dUSd&

A Proba  A @ /inia de start

A% rontul solventului

+igura 8.,3 Cromatogramă obţinută prin tehnica (/C.

8.1.2.) +actorul (e ca%acitate actorii dU !distanţa parcursă de analit de la linia de start# şi d & !distanţa parcursă de solvent de la linia de start# pot fi raportaţi la t U !timpul necesar solventului să parcurgă o anumită distanţă# şi t & !timpul necesar solutuluiSanalitului să parcurgă o anumită distanţă#. (impul petrecut de analitSsolut în faza mobilă este egal cu distanţa parcursă împărţită la viteza liniară a solventului, u. t&

=

dU u

olutul nu ajunge la acest punct până când faza mobilă nu parcurge distanţa d &. tU

=

d& u

actorul de capacitate se notează cu 'X şi este dat de relaţiaB '′ =

d&

−

dU

dU

actorul de capacitate poate fi e"primat şi prin intermediul factorilor U f . ,−

dU

'′ =

d&

dU d&

=

, − U f U f

actorii de capacitate astfel obţinuţi pot fi folosiţi pentru dezvolatrea cromatografiei pe coloană. /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU

2otiţe curs 03 


8.1.2., 4năl"imea unui taler cromatografic $nălţimi ale talerelor pot fi obţinute pentru anumite tipuri de cromatoplăci din tehnica (/C. 2umărul de talere teoretice se poate calcula cu relaţia  dU 2 =,5   A

 3   

$nălţimea unui taler se calculează cu relaţiaB 6

=

dU 2

unde dU şi A sunt cele definite în +igura 8.,.

8.1.5 A%lica"ii ale cromatografiei n strat su!"ire (ehnica (/C se foloseşte atât la determinări calitative !U f T metoda comparării valorilor U f # cât şi determinări cantitative !prin metode gravimetrice, volumetrice sau spectrofotometrice în EJ şi <#. 1atele de la o singură cromatogramă, în mod uzual, nu furnizează informaţii suficiente pentru a permite identificarea unor specii prezente într0un amestec din cauza variabilităţii factorului U f cu mărimea probei, numărul de talere şi condiţiile de la migrare. Cei mai importanţi factori care determină mărimea factorului U f includ grosimea fazei staţionare, umiditatea fazelor mobilă şi staţionară, temperatura, gradul de saturare a camerei cromatografice în vaporii fazei mobile, mărimea probei. @ceste variabile nu pot fi controlate dar pot fi parţial ameliorate prin folosirea unui factor de retenţie relativ !U rel# determinat pentru analitul i în raport cu o substanţă standard, stB Urel

distanta parcursa de analit =

=

distanta parcursa de o substanta standard

U f!i# U f!st#

Pentru identificarea spoturilor evidenţiate la dezvoltarea cromatogramei se poate folosi metoda comparării factorului U f cu acela al unor substanţe pure !standarde#. Edentificarea se poate realiza şi prin tehnica prelevării e"acte a spotului evidenţiat pentru un analit. Prelevarea se poate realiza cu o spatulă, aducerea componentei prelevate într0o eprubetă, dizolvarea analitului cu un solvent potrivit, separarea de faza staţionară insolubilă prin centrifugare şi analiză prin spectrometrie de masă, rezonanţă magnetică nucleară sau spectroscopie în infraroşu. Comparativ cu tehnica cromatografiei de lichide de înaltă performanţă, tehnica (/C are câteva puncte slabe cum ar fiB a# iteza solventului nu este constantă, poate fi modificată prin mărimea particulelor fazei staţionare şi tipul solventului folosit. căderea vitezei de migrare poate duce la lărgirea spoturilor. b# Compoziţia solventului se poate modifica în timpul separării datorită unor echilibre induse de faza staţionară. @cest fapt conduce la factori de capacitate care sunt greu de reprodus şi implicit la separări nereproductibile. /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU

2otiţe curs 03 


8.) Cromatografia ionică #IC' @naliza amestecurile de anioni, cationi sau compuşi polari a impus necesitatea utilizării cromatografiei ionice, lucru dificil sau imposibil de realizat eficient prin celelalte variante ale cromatografiei de lichide. @ceasta variantă a cromatografiei de lichide de înaltă presiune se bazează pe utilizarea coloanelor cu schimbători de ioni respectiv a materialelor rezistente la agresivitatea acizilor, bazelor sau sărurilor T substanţe a caror soluţii apoase servesc drept eluenţi. 1intre toate elementele unui sistem cromatografic faza staţionară reprezintă elementul cheie deoarece determină mecanismul de separare care este operativ. &ecanismul de separare, în schimb, dictează alegerea fazei mobile şi adeseori care metode de detecţie ar putea fi aplicate în mod corespunzător. Pentru a înţelege importanţa fazei staţionare în procesul cromatografic este necesar să se cunoască unele aspecte privind compoziţia sa şi, în acelaşi timp, este util să se cunoască cum se prepară o fază staţionară. 8.).1 Schim!ătorii (e ioni chimbătorii de ioni reprezintă cea mai utilizată fază staţionară în cromatografia de ioni.

2otiţe curs 03 3


8.).) 6recursori %olimerici ai ră-inilor schim!ătoare (e ioni $n cromatografia ionică faza staţionară este o răşină polimerică interlegată ! +igura 8.#, de obicei de forma divinil benzen interlegat cu polistiren, cu grupări funcţionale ionice ataşate covalent. Uăşinile schimbătoare de ioni pot fi împărţite în patru categoriiB schimbători cationici puternic acizi, schimbători cationici slab acizi, schimbători anionici puternic bazici, schimbători anionici slab bazici.

stiren divinil benzen /ocaţie pentru schimb ionic

Enterlegătură

+igura 8.3 tructuri ale stirenului, divinil0benzenului şi un copolimer modificat de stiren0divinil0benzen pentru a fi folosit ca răşină schimbătoare de ioni. ite0ul pentru schimb este de obicei în poziţia para şi nu este neapărat necesar să fie legat la toate unităţile de stiren. U0 poate fi T7=06N, C7706N, 026=N760 sau T 2!C6=#=N760.

Cel mai uzual mod de preparare a unei răşini schimbătoare de ioni este acela în care mai întâi se prepară un polimer neutru pe bază de stiren, pentru ca mai apoi acesta să fie modificat chimic pentru a introduce grupările cu funcţiuni ionice. $n mod alternativ, monomerii care conţin funcţiunea ionică necesară pot fi polimerizaţi printr0o interlegătură potrivită pentru a obţine un schimbător de ioni, dar materialele obţinute pe această cale nu sunt utilizate în mod obişnuit în cromatografia ionică. D"istă două căi principale pentru obţinerea precursorilor polistirenici folosiţi în cadrul majorităţii răşinilor schimbătoare de ioni. 1in prima se obţin produşi ce sunt cunoscuţi drept polimeri de tip gel, iar din cea de0a doua cale se obţin materiale macroporoase. 1iferenţa structurală dintre cele două tipuri de polimeri are implicaţii importante în privinţa schimbătorului de ioni, în special în ceea ce periveşte viteza de schimb ionic, mai ales atunci când aceştia au dimensiuni mari.

8.)., *ecanisme (e se%arare chimbătorii de ioni sunt materiale solide 0 derivaţi ai unor polimeri reticulaţi !poroşi#, obţinuţi prin legarea de catenele hidrocarbonate, ramificate, ale unor grupe funcţionale aşa cum sunt reprezentate schematizat în Ta!elul 8.1. Hranulele de răşină se solvatează cu apa tinzând spre /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU

2otiţe curs 03 =


un volum0 limită ma"im. Prin spaţiile dintre catenele unui cationit pot pătrunde prin difuziune în faza lichidă doar molecule neutre sau cationi, anionii fiind e"cluşi. Pătrunderea în granule a ionilor de semn contrar este îngreunată şi de Yefectul 1onnan+ de membrană, care apare pe suprafaţa granulei şi provoacă o selectivitate a acesteia la pătrunderea ionului, în funcţie de dimensiunile acestuia.
@cid carbo"ilic

chimbători anionici puternic bazici

@mine cuaternare

chimbători anionici slab bazici

@mine

D"emple 07=0 0C63C637=0 0C770 0C63C770 0C632!C6=#=N 0C63C632!C63C6=#=N 026=N 0C63C6326!C63C6=#3N

1e e"emplu, prin introducerea unui amestec de 2a N şi >N pe o coloana umplută cu un cationit aceştia vor fi fi"aţi pe răşină, eliberând o cantitate echivalentă de ioni hidroniu. U06 N 2aN → U02a N 6N U06 N >N → U0> N 6N Pompând un eluent prin coloana, !6Cl diluat#, ionii 6 N din acid, fiind în concentraţie mai mare, vor deplasa ionii fi"aţi, prin echilibre ionice similare spre o porţiune inferioară iar aceştia se vor putea fi"a din nou, puţin mai jos, pe alte centre de schimb din coloană. U02a N 6N → U06 N 2aN U0> N 6N → U06 N >N Uepetarea procesului duce la migrarea ionilor prin coloană, însă, datorită afinităţii sporite a grupărilor funcţionale tip 07 =0 pentru >N faţă de 2a N, primul grup de ioni !sau prima zona# care va ieşi din coloană va fi cel format din ionii de sodiu şi abia după un timp va iesi grupul conţinând ionii de potasiu, asigurând separarea celor doi ioni. imilar sunt separate şi amestecuri mai complicate, uneori fiind necesare coloane mai lungi. 1eoarece creşterea diametrului granulelor conduce la apariţia unor zone mai largi şi separări mai de durată, iar granulele se deformeaza mecanic în timp, răşina se aplică sub formă de peliculă subţire pe un miez de sticlă sferică, eficacitatea separării şi fiabilitatea coloanelor crescând foarte mult. azele mobile în EC sunt simple T de obicei soluţii apoase diluate de acizi sau baze.



8.). Con(uctometria 7 miloc mo(ern (e (etec"ie n cromatografia ionică &onitorizarea conductivităţii prezintă o serie de caracteristici care oferă acestei proprietăţi posibilitatea să fie folosită ca mijloc de detecţie. Conductivitatea este o proprietate universală a soluţiilor ionice, reprezentând de fapt proprietate proporţională cu concentraţia componenţilor. 1eoarece fazele mobile folosite în cromatografia cu schimbători de ioni sunt ionice !de aceea de multe ori aceste faze prezintă o conductivitate ridicată# detectorul de conductivitate folosit în această metodă este un detector al unei proprietăţi comune. $n acest tip de detecţie, conductivitatea de fond a eluentului folosit în cromatografia cu schimb ionic este intensificată, dar celula de conductivitate este transformată dintr0un detector al unei proprietăţi comune într0un detector de proprietate al unui solut. @cest fundament teoretic a fost e"ploatat şi desăvârşit prin adăugarea unei a doua coloane de schimb ionic între separator şi celula de conductivitate care transportă ionii eluentului, sau care modifică conductivitatea acestora la valori mai mici, în timp ce conductivitatea eluaţilor este intensificată. Procedura a devenit cunoscută sub numele de supresia eluentului şi a fost raportată pentru prima dată în anul -98 de către mall şi colaboratorii săi. &ai târziu, a apărut posibilitatea cuplării directe a coloanei schimbătoare de ioni cu detectorul de conductivitate şi metoda a fost cunoscută sub numele de cromatografia ionică cu o singură coloană. Zinând cont de această procedură de lucru, detectorii conductometrici pot fi incluşi în două mari categorii tip detectori conductometrici cu supresie şi detectori conductometrici fără supresie. 8.)..1 6rinci%iul (etectorilor con(uctometrici (e su%resie 1etectorii conductometrici se utilizează cu precădere în cromatografia pe schimbători de ioni şi sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici. unt detectori specifici şi sunt suficient de sensibili !8 pg T  ng#. 1etectorii conductometrici sunt sisteme caracterizate de sensibilitate ridicată, stabilitate, fle"ibilitate, acurateţe şi reproductibilitate, şi de capacitate mare de a furniza date de încredere. 1etectorii conductometrici oferă posibilitatea unei cuantificări a anionilor, cationilor, metalelor şi acizilor organici aflaţi în diferite probe, în concentraţii mai mici de ordinul părţilor per bilion !ppb#. 2oile micro0procesoare, bazate pe circuite electrice, îmbunătăţesc sensibilitatea detecţiei analitului prin reducerea zgomotului de fond. 1e obicei, la ieşirea din coloana cromatografică ionii nu pot fi detectaţi suficient de sensibil pe cale conductometrică în mod direct, deoarece au concentraţii coborâte şi sunt conţinuţi în eluentul format dintr0un electrolit cu o concentraţie comparabilă sau chiar mai mare. Pentru îmbunătăţirea performanţelor s0a recurs la supresorul ionic care a fost realizat pentru prima dată în -98 de un grup de cercetători americani !6. mall şi colab.#. Eniţial sistemul a constat dintr0o coloană0 supresor, plasată în continuarea celei de separare, cu rolul de a transforma eluentul !un acid sau o bază tare# în apă. 1e e"emplu, pentru eluent acid !acidul clorhidric# coloana supresor este umplută cu o răşină schimbătoare de anioni cu formula generală U076, caracterizată de capacitate de schimb mare. /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU



Coloana de separare poate fi redată ca U6 şi coloana de supresie ca U76. Dluentul care conţine acid clorhidric diluat de e"emplu, la ieşirea din coloana de separare va pătrunde în coloana supresor unde se va petrece reacţiaB U076 N !6N N Cl0# [ U0Cl N 637 Ueacţie prin care acidul utilizat drept eluent este trecut în apă care este un neelectrolit. $ntre timp, sărurile se transformă în hidro"izii corespunzătoriB U076 N !2aN N Cl0# [ U0Cl N !2aN N 760# U076 N !>N N Cl0# [ U0Cl N !>N N 760# @pa fiind practic neionizată va permite detecţia sensibilă a hidro"izilor total ionizaţi ce au apărut din zonele formate iniţial din cele două săruri. 1eoarece şi eluentul este format din ioni care conduc curentul, înainte de supresor semnalul va fi mai slab. 1acă se urmăreşte separarea a doi anioni, de e"emplu Cl 0 şi %r 0, eluentul ar putea fi, nu un acid ci o bază diluată, de e"emplu 2a76, sau 2a6C7 =. $n acest caz separarea se va realiza pe coloane de anioniţi şi eluentul ar fi de e"emplu 2a76. /a ieşirea din coloana de separare avem în eluentul folosit zonele separate ale sărurilor anionilor supuşi analizei, adică 2aCl şi 2a%r. upresorul utilizat în acest caz va fi format dintr0o răşină de forma U06 în e"ces pe care se va petrece reacţiaB U06 N !2aN N 760# [ U02a N 637

8.)..) Su%resorul electrochimic $n prezent, supresorul electrochimic !sau autosupresorul# din cromatografele ionice recente a înlocuit coloana cu schimbători de ioni cu membrane schimbătoare de ioni. $n plus, procesul de schimb ionic în cromatografele moderne este accelerat prin electrodializă. $n acest fel s0a mărit viteza procesului şi s0a micşorat volumul mort. &ai mult, a crescut durata de funcţionare a detectorului. $n aceste tipuri de detectori, în general, celula detectorului este localizată într0o incintă specială de reglare a temperaturii, care are rolul de a izola celula detectorului de fluctuaţiile e"terne de temperatură.

Cercetarea criminalistică a microurmelor Dluent !2a76#

0

0

Probă ! , Cl , 74

0

eparare fără supresie L

Eonii interferenţi

74

30

0

Coloana analitică



0

Cl

(imp 2a, 2aCl, 2a 374, în 637 eparare prin supresie istem de supresie cu regenerare

Ueziduuri

637

L

0

Cl 

74

0

0

6, 6Cl, 6 374, în 637 (imp

+igura 8.23 Ueprezentarea schematică a procesului de îmbunătăţirea a raportului semnal0zgomot

@ceste procese convertesc în mod efectiv un detector de conductivitate dintr0un detector al unei proprietăţi comune, într0un detector de proprietate specific capabil să detecteze concentraţii e"trem de joase !ppb# ale ionilor cu specificitate deosebită. Pentru sistemele de supresie cu auto regenerare se cunosc două tipuri de sistemeB sisteme anionice de supresie cu auto0regenerare !analiza anionilor# şi sisteme cationice de supresie cu auto0regenerare !analiza cationilor#. $n funcţie de sistemul de operare, supresorii pot fi incluşi în trei categoriiB supresori care operează în modul ciclic, supresori care operează în modul e"tern şi supresori în modul chimic. Chimismul din sistemul de supresie cu auto0regenerare anionică este ilustrat în +igura 8.5. D"emplul este dat pentru situaţia în care ca eluent se foloseşte hidro"idul de sodiu, dar în calitate de eluent pot fi folosite şi amestecurile carbonatSbicarbonat de sodiu sau acid boricStetraborat. $n acest sistem, apa este folosită ca agent de regenerare care suferă procesul de electroliză cu formare de o"igen în stare gazoasă şi ioni de hidroniu în camera anodică, şi cu formare de hidrogen gazos şi ioni hidro"il în camera catodică. Eonii hidro"il formaţi la catod sunt înlăturaţi din camera eluentului printr0un proces de e"cluziune. &embranele schimbătoare de cationi permit transportul ionilor hidroniu de la camera anodică în camera eluentului unde se produce neutralizarea hidro"idului din eluent, în timp ce ionii de sodiu din eluent sunt transportaţi de0a lungul membranei în camera catodului, menţinînd bilanţul de sarcini. Uezultatul acestui proces este îmbunătăţirea semnificativă a raportului semnal0zgomot datorită a trei factoriB # conductivitatea de fond a eluentului descreşte după cum eluentul este supus procesului de supresie la o conductivitate medie, mai mică în valoare, corespunzătoare apei\ 3# conductivitatea analitului creşte prin asocierea cu ionii hidroniu din camera eluentului, şi =# contorizarea picurilor corespunzătoare interferenţilor este înlăturată.



Cercetarea criminalistică a microurmelor @nod N

@nalit 2aN760 eluent

Ueziduuri

Ueziduuri

Catod 0

2aN760 şi 63

637 şi 73

760 6N

N

6 N 73

2aN 6N N 760W637

637

63 N 760

637 @nalit şi 637

637

&embrană schimbătoare de cationi

pre detector

637

&embrană schimbătoare de cationi

+igura 8.53 @utosupresia într0un sistem de supresie cu auto0regenerare anionică.

Chimismul sistemului de supresie cu auto0regenerare cationică este prezentat în +igura 8.9. Ki în aceste sisteme, ca agent de regenerare se foloseşte apa care suferă procesul de electroliză cu formare de hidrogen în stare gazoasă şi ioni hidro"il în camera catodică şi o"igen gazos şi ioni hidroniu în camera anodică. Eonii hidroniu generaţi la anod sunt înlăturaţi din camera eluentului prin acelaşi proces de e"cluziune întîlnit şi în cazul celuilalt tip de sistem. &embranele schimbătoare de anioni permit ionilor hidro"il să fie transportaţi din camera catodului în camera eluentului cu neutralizarea ionilor hidroniu în eluent, în timp ce alţi ioni ai eluentului !&@ 0# sunt transportaţi de0a lungul membranei în camera anodică cu menţinerea bilanţului de sarcină. Uăspunsul va fi puternic îmbunătăţit prin asocierea cationilor analitului cu ionii hidro"il caracterizaţi de conductivităţi ridicate ca valoare.


2otiţe curs 03 ?


@nod N

@nalit N 0 N 0 2a 76 &@ 6 eluent

Ueziduuri

6N&@0şi 73

Catod Ueziduuri

0

637 şi 63

6N &@0

760 N

N

0

6 N 76 W637

63 N 760

6 N 73 637

63 7 @nalit şi 637

637

&embrană schimbătoare de anioni

pre detector

63 7

&embrană schimbătoare de anioni

+igura 8.9B @utosupresia într0un sistem de supresie cu auto0regenerare cationică.

8.).., +unc"ionarea autosu%resorului n anali0a anionilor Procesele de supresie şi de regenerare electrochimică în timpul analizei anionilor şi, respectiv, a cationilor pot fi redate diferenţiat după cum urmează. Pentru analiza anionilor, celulele de regenerare electrochimică şi supresie sunt umplute cu răşini puternic schimbătoare de cationi în forma hidrogen. $n timpul supresiei, conductivitatea înaltă a fazei mobile este convertită la conductivitatea joasă a apei prin schimbul ionic al ionilor de sodiu din faza mobilă cu ionii de hidrogen din răşina schimbătoare de cationi. $n acelaşi timp conductivitatea joasă a anionilor analitului este convertită la conductivitatea ridicată a acizilor lor !+igura 8.8#. emnalul de fond va fi redus iar semnalul analitului va fi intensificat, şi astfel detecţia va fi îmbunătăţită. $n timpul regenerării electrochimice, efluentul de la detector suferă electroliză atunci cînd un curent este aplicat prin celulă. Eonii hidroniu şi o"igenul gazos sunt generaţi la sistemul de intrare al celulei !anodul#, în timp ce ionii hidro"il şi hidrogenul gazos sunt generaţi la sistemul de ieşire al celulei !+igura 8.:#. $n acest proces ionii de hidrogen sunt transportaţi prin intermediul efluentului de la detector de0a lungul răşinii schimbătoare de cationi în forma sodiu, şi convertesc răşina înapoi la forma hidrogen.


2otiţe curs 03 -


aza mobilă 2a76 N Uăşina07 =06N W Uăşina07 =02aN N 6 37 @naliţii 2a] N Uăşina07=06N W Uăşina07=02aN N 6] ] W %r 0, Cl0, 27=0, C6 =730, C6 =7 =0, etc Celula *@Y 0 upresie 1e la

pre

coloană

detector Uăşina07=02a N

Uăşina07=06N

+igura 8.83 Principiul funcţionării supresorului la analiza anionilor. Uăşina07=02aN N 6N W Uăşina07=06N N 2aN

Celula *%Y 0 Uegenerare pre reziduuri

1e la detector

0

0

N

3637 N 3e W 376 N 63

0

3637 W 46 N 73 N4e

+igura 8.:3 Procesul de regenerare a autosupresorului la analiza anionilor.

8.).. +unc"ionarea autosu%resorului n anali0a cationilor Pentru analiza cationilor, celulele de regenerare electrochimică şi cele de supresie sunt umplute cu răşini puternic schimbătoare de anioni în forma hidro"il ! +igura 8.1;#. aza mobilă N

0

N

0

6Cl N Uăşina02U = 76 W Uăşina02U= Cl N 637 @naliţii &Cl N Uăşina02U=N760 W Uăşina02U=NCl0 N &76 & W > , 2a , Ca , etc Celula *@Y 0 upresie 1e la

pre

coloană

detector N

0

Uăşina02U= Cl

N

0

Uăşina02U= 76

+igura 8.1;3 Principiul funcţionării supresorului la analiza cationilor.


2otiţe curs 03 3


$n timpul supresiei, conductivitatea înaltă a fazei mobile este convertită la conductivitatea joasă a apei prin schimbul ionic al ionilor de clorură !de e"emplu# din faza mobilă cu ionii de hidro"id din răşina schimbătoare de anioni. $n acelaşi timp conductivitatea joasă a cationilor analitului este convertită la conductivitatea ridicată a hidro"izilor lor. emnalul de fond va fi redus iar semnalul analitului va fi intensificat, şi astfel detecţia va fi îmbunătăţită. $n timpul regenerării electrochimice, efluentul de la detector suferă electroliză atunci cînd un curent este aplicat prin celulă ! +igura 8.11#. Polaritatea celulei este inversată, comparativ cu analiza anionilor, şi catodul este localizat la intrarea în celulă. Eonii hidro"il şi hidrogenul gazos sunt generaţi la sistemul de intrare al celulei !catodul#, în timp ce ionii hidroniu şi o"igenul gazos sunt generaţi la sistemul de ieşire al celulei. $n acest proces ionii hidro"il sunt transportaţi prin intermediul efluentului de la detector de0a lungul răşinii schimbătoare de anioni în forma clorură, şi convertesc răşina înapoi la forma hidrogen. Uăşina02U=NCl0 N 760 W Uăşina02U=N760 N Cl0 Celula *%Y 0 Uegenerare pre reziduuri

3637 W 46N N 73 N4e0

1e la detector

3637 N 3e0 W 376 0 N 63

+igura 8.113 Procesul de regenerare a autosupresorului la analiza cationilor.

8., Cromatografia (e lichi(e Cromatografia de lichide include cromatografia planară şi pe coloană. Cromatografia de lichide pe coloană, poate fi clasică şi de înaltă performanţă !6P/C#. 8.,.1 Cromatografia (e lichi(e %e coloană clasică #CL' Dste o tehnică care se caracterizează prinB a# folosirea coloanelor scurte cu diametrele relativ mari, umplute cu particule mai mari decât ? de micrometri\ b# operarea la presiune atmosferică sau mai mică\ c# analiza fracţiunilor individuale, colectată de la baza coloanei. &etoda este insuficientă în cazul probelor de mare comple"itate şi prezintă o mare durată de e"ecuţie. e poate aplica în scopuri analitice şi preparative. 8.,.) Cromatografia (e lichi(e %e coloană instrumentală Ueprezintă tehnică ce se caracterizează prinB /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU

2otiţe curs 03 3


a# b# c# d#

folosirea coloanelor lungi şi înguste umplute cu particule mici\ separări de înaltă eficienţă realizate într0un timp scurt\ operarea la presiune ridicată\ detecţia continuă a componen ților separati cu posibilitate de automatizare a procesului de separare\ e# precizia determinărilor cantitative\ f# capacitatea de a separa specii nevolatile sau instabile termic. Cromatografia de lichide pe coloană de înaltă performanţă !6P/C#B necesită crearea unor condiţii optime de transport a fazei lichide sub presiune\ necesită asigurarea atingerii rapide a echilibrelor de distribuţie şi a detecţiei optime pentru componenţii separaţi.

8.,., Clasificare &etodele cromatografiei de lichide sunt complementare şi principalele metode utilizate în cromatografia de lichide precum şi întrepătrunderea acestora în vederea utilizării lor în practică sunt prezentate în +igura 8.1).

0 0 0 0 0

(ehnica cromatografiei de lichide poate cuprinde prin urmare tehnici precumB cromatografia de adsorbţie !cromatografia /0 bazată pe mecanisme de adsorbţie#\ cromatografia prin schimb ionic !CE sau EC bazată pe mecanisme de schimb#\ cromatografia de e"cludere difuzie !cromatografia prin penetraţie prin gel şi filtrare pe gel#\ cromatografia de repartiţie !cromatografia /0/ bazată pe mecanisme de repartiţie#\ alte metode includ cromatografia de afinitate sau schimb de liganzi şi cromatografia perechilor ionice. Cresterea polaritatii olubili in apa

Ensolubili in apa

Eonici

2epolari Polari neionici Partitie .3

chimb ionic

@dsorbtie

Partitie cu faze Partitie normala inversate .=

+igura 8.1)B @plicaţiile cromatografiei de lichide.

.4 D"cluziune .8 Permeatie prin gel

iltrare prin gel

.5




&etodele cromatografiei de lichide pot fi utilizate funcţie de scopul urmăritB  Pentru moleculele cu greutate moleculară mare se foloseşte cromatografia de e"cludere T difuzie\  Pentru compuşii ionici cu greutatemoleculară mică se foloseşe în mod curent CE.  Pentru speciile neionice, dar puţin polare se foloseşte cromatografia de repartiţie.  Cromatografia de adsorbţie este aleasă pentru specii nepolare izomere structural sau compuşi ce aparţin unor clase cum ar fi separarea hidrocarburilor alifatice, aromatice, alcoolilor inferiori.

8.,. A%aratura utili0ată n cromatografia (e lichi(e 1upă cum se observă în +igura 8.1, sistemul cromatografului de lichide este compus din 4 componente de bază.
Amorti0are %ulsuri

In8ector& ti% =5 căi>

6om%ă 6re7coloană

ă n a o l o C

Re0er1oare fa0ă mo!ilă

+igura 8.1,3 Prezentarea schematica a unui cromatograf de lichide !6P/C# modern.

/etector

. coloana cromatografică în care se desfăşoară procesul de separare al componenţilor. 3. dispozitive de introducere a probei care poate fi dependent de tipul de analiză efectuatB calitativ sau cantitativ. =. sistem de alimentare cu fază mobilă care conține circuitul de solvent care transportă faza mobilă prin coloana cromatografică. @cest sistem de alimentare includeB a. rezervoare cu fază mobilă de aceeaşi polaritate sau polarităţi diferite\ b. dispozitive de reglare a vitezei de curgere\ c. dispozitive de monitorizare a presiunii debitului\ d. dispozitiv de purificare\ e. precoloane de amestecare aşezate în faţa coloanei cromatografice. 4. detectori cu sau fără sistem de înregistrare !reprezintă sistemul de identificare şi dozare a componenţilor din amestec#. istemul este astfel construit încât să permită transmiterea fazei mobile corespunzătoare pentru o eluţie continuă sau o eluţie în gradient. aza mobilă curge printr0o cameră de preamestecare plasată între pompă şi rezervoare pentru a compensa schimbările făcute în fază. Pompa pulsează faza mobilă din camera de amestecare în coloana cromatografică şi apoi o /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU

2otiţe curs 03 3=


împinge spre detector. iteza de curgere a fazei mobile trebuie să se menţină constantă şi reproductibilă. Componenţii situaţi în coloană ajung direct la detector care transformă diferenţa unor proprietăţi dintre componenţi şi faza mobilă în semnal electric, semnal care este amplificat şi înregistrat sub forma unor cromatograme care se analizează calitativ şi cantitativ. $n cromatografia de lichide se folosesc coloane confecţionate din metale !@l, Cu#, oţel ino"idabil, materiale plastice de o anumită duritate. 1iametrul poate varia între 3 T  cm. /ungimea coloanei este de la 3 până la  cm.
8.,.2 +a0e mo!ile -i sta"ionare& %olaritate aza mobilă poate fi un singur solvent de compoziţie constantă în coloana cromatografică !cromatografia izocratică# sau un amestec de solvenţi de polaritate diferită în cromatografia cu gradienţi. Condiţiile pe care faza mobilă trebuie să le îndeplinească includB  să prezinte puritate înaltă\  vâscozitate scăzută\  punct de fierbere între 3 T 8  C\  reactivitate chimică scăzută\  compatibilitate cu detectorii utilizaţi\  inflamabilitatea şi to"icitatea ridicată să fie strict monitorizate. $n cromatografia de lichide trebuie să se ţină seama de polaritatea celor = componenţi care participă în procesul de separareB solut[ fază mobilă [ fază staţionară. Polaritatea solutului şi a fazei mobile se aleg apropiate şi net diferite de a fazei staţionare. a# polarităţi asemănătoare pentru !solut, fază staţionară# şi diferite de ale fazei mobileB viteze mici de deplasare, timp mare de separare. /ector 1r. Cecilia ARSENE Conf. 1r. Romeo Iulian OLARIU



b# polarităţi asemănătoare pentru !solut, fază mobilă# şi diferite de ale fazei staţionareB timp foarte scurt de separare. În cazul cromatografiei cu faze normale

aza staţionară este polară !silicaţi sau particule de silicagel sau lichide polare precum etilen glicol# iar faza mobilă este relativ nepolară !he"anul, izopropil eterul#. 1acă se consideră un amestec de analiţi @, %, C, polaritatea compuşilor @ ^ % ^ C, cu creşterea polarităţii fazei mobile, timpul de reţinere se micşorează şi ordinea de eluţie esteB C ^ % ^ @. 1e fapt componentul cel mai puţin polar iese primul din coloană. În cazul cromatografiei cu faze inverse

aza staţionară este nepolară !hidrocarburi, coloane C? şi C?# şi faza mobilă este polară. 1acă se consideră amestecul de analiţi @, %, C, polaritatea compuşilor @ ^ % ^ C, ordinea de eluţie esteB @ ^ % ^ C.

8. Cromatografia (e ga0e 8..1 As%ecte teoretice %aza separărilor cromatografice în fază gazoasă o constituie distribuţie componenţilor între două faze. uncţie de natura fazei staţionare !f # se întâlnescB  cromatografia H !CH, cromatografia gaz0solid# când fază staţionară este un solid !separarea este bazată pe mecanismul de adsorbţie#\  cromatografia H/ !CH/, cromatografia gaz0lichid# când faza staţionară este un lichid depus pe un suport inert !separarea este bazată pe un mecanism de repartiţie#. Principiile cromatografiei în fază gazoasă includB 0 reţinerea specifică a componenţilor pe coloană are loc datorită presiunilor diferite de vapori ale componenţilor de analizat\ 0 desorbţia componenţilor din faza staţionară în faza mobilă are loc cu atât mai rapid cu cât volatilitatea lor este mai mare. @vantajele cromatografiei de gaze faţă de a altor metode de separare includB 0 vâscozitatea redusă a fazei mobile permite folosirea coloanelor lungi, ridicând astfel eficienţa procesului de separare, 0 vâscozitatea redusă a fazei mobile conduce la stabilirea rapidă a echilibrelor de distribuţie, 0 atingerea rapidă a echilibrelor are ca efect o rezistenţă mică la transferul de masă ceea ce face posibilă o viteză mare de flu", 0 timpul de analiză este foarte scurt, aparatura relativ simplă se pretează la analize calitative, cantitative, pe lângă separarea componenţilor, 0 se aplică în domenii variate şi la o gamă largă de produse e"ceptând produşii labili din punct de vedere termic şi cei nevolatili.




8..) Sistemul ga0 cromatografic chema de principiu a unui cromatograf de gaze este prezentată în +igura 8.1. /e!it7metru Control (e!it Regulator %resiune

?loc in8ector

Se%tum

?locul (etector

+igura 8.13 chema de principiu a unui cromatograf de gaze. Cu%tor

+a0a mo!ilă

Coloană

Componentele majore ale instrumentului cuprindB 0 butelia ce conţine gazul purtător !faza mobilă# sub presiune !8 atm# 0 reductor de presiune şi sistem pentru reglarea şi măsurarea debitului 0 bloc injector !sistemul de injecţie# 0 coloana cromatografică0reprezintă sediul proceselor de separare\ poate fi confecţionată din metal, sticlă, poate fi dreaptă, sau forma literei < sau sub formă de spirală 0 cuptor !sistemul de termostatare a coloanei sau programare a rampelor de temperatură# 0 blocul detector cu amplificator amplifică semnalul dat de detector Hazul purtător !eluentul# este eliberat dintr0o butelie ce ţine gazul sub presiune.



8.., +a0a mo!ilă folosită n cromatografia (e ga0 Dluentul sau gazul purtător are rolul de a antrena şi de a transporta componentele amestecului de0 a lungul coloanei cromatografice. @cesta trebuie să îndeplinească o serie de caracteristici precumB 0 să fie inert !să nu reacţioneze cu componenţii probei sau cu faza staţionară 0 să efectueze separarea fără să afecteze viteza de desfăşurare a analizei 0 alegerea gazului purtător se face în funcţie de sensibilitatea detectorului, în funcţie de eficienţa separării şi de posibilităţile de interacţiune cu solutul sau faza staţionară\ de e"emplu la detectorul de conductivitate termică se aleg ca eluenţi gaze care au o conductivitate termică mult diferită de a componenţilor ce se separă 0 deoarece impurităţile din faza mobilă pot induce modificări asupra fazei staţionare, între sistemul de alimentare cu gaz şi instrument, se folosesc de obicei filtre sub forma sitelor moleculare 0 pentru a se obţine rezultate reproductibile debitul fazei mobile în timpul analizei trebuie menţinut constant. 8.. +a0e sta"ionare folosită n cromatografia (e ga0 azele staţionare folosite în cromatografia de gaz pot fiB polare !polietilenglicoli#, nepolare !cauciucuri siliconice#, intermediare, cu punţi de hidrogen sau specifice !separarea amestecurilor racemice#. azele staţionare sunt lichide sau solide. Fazele staţionare solide au rolul de a furniza un suport pentru faza mobilă. aza staţionară solidă trebuieB să fie poroasă, să fie inertă şi să nu recţioneze cu componenţii probei, să prezinte !la suport# suprafeţe mari, să aibă rezistenţă mecanică şi termică ridicată. uportul solid este format din particule mici, sferice şi uniforme. Prima umplutură utilizată pentru o coloană cromatografică a fost constituită din pământuri diatomice provenite din scheletele unor plante monocelulare. Chromosorb P, A, H reprezintă faze staţionare prelucrate în flu" de 2a3C7= după calcinare. 7 problemă des întâlnită în HC a constituit0o adsorbţia fizică a speciilor de analiţi polari sau polarizabili, precum alcooli sau hidrocarburi aromatice, la suprafaţa silicaţilor umpluturii coloanei sau a pereţilor coloanei. @dsorbţia rezultă în picuri deformate. 0a arătat că adsorbţia este o consecinţă a grupărilor silanolice care se formează pe suprafaţa silicaţilor prin reacţie cu umiditatea. 7 suprafaţă de silice hidrolizată apare în forma 76 i

7

76 i

7

76

7

i

Hruparea i76 de la suprafaţa suportului are afinitate foarte ridicată pentru molecule organice polare şi tind să le reţină prin adsorbţie. &aterialele suport pot fi dezactivate prin silanizare cu dimetilclororsilan !1&C#.



Cercetarea criminalistică a microurmelor C6= i

76 N Cl

i

C6= Cl

C6=

i

7

Cl N 6Cl

i C6=

1upă spălare cu alcool, al doilea Cl este înlocuit de o grupare meto"i. C6= i 7

C6=

i Cl N C6=76 C6=

i 7

i 7C6= N 6Cl C6=

uprafeţele silanizate încă mai pot prezenta adsorbţie reziduală care derivă din impurităţile o"izilor metalici din elementele diatomice. Empurităţile pot fi înlăturate prin spălare cu acid. Fazele staţionare lichide se realizează folosind un lichid ales în funcţie de natura amestecului care trebuie separat. e pot folosi fazeB solide, lichide, nepolare, polare. Proprietăţile fazelor lichide imobilizate într0o coloană gaz0lichid cromatografică includB # volatilitate scăzută !ideal, punctul de fierbere al lichidului ar trebui să fie cu cel puţin  oC mai mare decât temperatura ma"imă de operare a coloanei#, 3# stabilitate termică, =# nereactivitate chimică. azele staţionare lichide sunt formate din lichide nevolatile având o compoziţie chimică foarte variată !peste  de tipuri#. Pentru a se putea lega chimic numărul acestora a fost restrâns la cele care pot, prin sinteza, să formeze un film grefat pe partea internă a coloanei, preferaţi fiind polisilo"anii şi polietilenglicolii fiecare într0o varietate care sa permită modificarea polarităţii acestora. Pentru a avea un timp rezonabil de rezidenţă în coloană, o specie trebuie să prezinte un anumit grad de compatibilitate !solubilitate# cu faza staţionară. Polaritatea este efectul câmpului electric în imediata vecinătate a unei molecule şi este măsurat de momentul de dipol al speciei. azele staţionare polare conţin grupări funcţionale precum TC2, 0C7, şi T76. azele staţionare tip hidrocarburi şi dialchil silo"anii sunt nepolare în timp ce fazele poliesterice sunt foarte polare. @naliţii polari includ alcooli, acizi, amine, speciile de polaritate medie includ eterii, cetonele şi aldehidele. 6idrocarburile saturate sunt nepolare. $n general polaritatea fazei staţionare trebuie să se potrivească cu cea a componenţilor probei. Când potrivirea este bună, ordinea eluţiei este determinată de punctele de fierbere ale eluenţilor. &aterialul de plecare în obţinerea fazelor staţionare este polidimetilsilo"anului a cărui structură esteB U U

i U

7

U

U

i

7 i

U

nU

Parte din polidimetilsilo"ani au gruparea U de tip TC6 = şi conduc la un lichid relativ nepolar. $n alte cazuri, o parte din grupările metil sunt înlocuite de grupări funcţionale precum fenil !0C 568#, cianopropil !0C =65C2# şi trifluoropropil !0C =65C=#, ceea ce duce la creşterea polarităţii lichidelor. Carbo)a" este un polietilen glicol cu structura 670C6 30C630!70C6 30C63#n076 cu utilizări ;n separarea speciilor polare.


2otiţe curs 03 3?


8..2 /etectori folosi"i n cromatografia (e ga0 e clasifică înB 0 universaliB dau răspuns pentru un număr foarte mare de componenţi 0 specificiB sunt aplicabili doar la anumiţi componenţi cu anumite grupări funcţionale. Cei mai importanţi detectori suntB 0 detectori de conductibilitate termică 0 catarometru 0 detectori de ionizare în flacără 0 detectori de ionizare cu radiaţii !detector cu captură de e 0 utilizaţi în analiza pesticidelor#. Catarometrul este un detector universal, sensibilitate  08 g componentSs !ceilalţi detectori pot atinge sensibilitate de până la  08 g componentSs#. Dste nespecific, nedestructiv şi se poate cupla cu alte instrumente cum ar fi spectrometrele de masă sau spectrofotometrele utilizate în infraroşu. Principiul de funcţionare se bazează pe măsurarea diferenţei de conductibilitate termică dintre component şi eluent.
2otiţe curs 03 3-

Tehnici Cromatografice

Recommend Documents