ADN RECOMBINANTE El térm términ ino o ADN reco recomb mbin inan ante te hace hace refe refere renc ncia ia a la crea creaci ción ón de nuev nuevas as combinaciones de segmentos o de moléculas de ADN que no se encuentran juntas de manera natural. Es decir, al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño en un ADN recetor. !a técnica del ADN recombinante se utili"a en estudios sobre la regulación de la exresión génica, en la regulación de la roducción comercial de s#ntesis de rote#nas como la $nsulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de organismos transgénicos % en la amlificación del ADN, es decir, en obtener un gran n&mero de coias de un gen determinado. En este <imo caso, existe una técnica mejor, denominada con las siglas '() '().. !a técnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector % éste, ste, a su ve", e", dentro ntro de una una cél célula, ula, denom nomina inada célul célula a anfit anfitriona riona.. Arovechando la maquinaria celular, el gen se exresa, sinteti"*ndose as# la rote#na codificada en el gen. Adem*s, al dividirse la célula, las nuevas células formadas contienen ese gen que también sinteti"an esa rote#na. +e genera un gruo celular que contiene un genoma distinto. !as etaas en la roducción de ADN recombinante son las siguientes -. . /. 1. 2. 3.
'rearación de la secuencia del ADN ara su clonación 'rearación de un vector de clonación 0ormación del ADN recombinante $ntroducción del ADN recombinante en una célula anfitriona 'roagación del cultivo Detección Detección % selección selección de los clones clones recombin recombinantes antes
1. Preparac Preparación ión de la secue secuencia ncia del del ADN ADN para su clonac clonación ión Es la arte arte esen esenci cial al del del roc roces eso, o, %a que que el ADN debe debe sea seara rars rse e % concentrarse. • •
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'artimos de células con n&cleo, que deben ser lisadas 4rotas5. !as !as rote# rote#nas nas estruc estructur turale ales, s, en"ima en"imas, s, A)N % restos restos molecu molecular lares es deben seararse del ADN. El ADN obte obteni nido do se conc concen entr tra a % se frag fragme ment nta a or or acci acción ón de las en"imas de restricción. restricción. +e a#sl a#sla a el ADN que que se dese desea a clon clonar ar,, or or ejem ejeml lo, o, medi median ante te cromatograf#a l#quida o or centrifugación. +i el ADN debe exresarse ha% que añadir los segmentos reguladores de la exresión génica.
2. Preparac Preparación ión de un vector vector de clonación clonación
El vector es el ortador de la secuencia de ADN que se desea clonar. 6n vector debe resentar las siguientes caracter#sticas •
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6na equeña secuencia de ADN f*cil de aislar, como, or ejemlo, un l*smido. (ontener distintos untos de ataque a en"imas de restricción % que sean conocidos. 'oder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad. )elicarse de forma indeendiente al ADN de la célula anfitriona. 'oseer un gen marcador con el que uedan identificarse % seleccionar las células clonadas. 6n ejemlo de marcador uede ser la resistencia a un antibiótico.
!as etaas del roceso consisten en •
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(ortar el vector con en"imas de restricción, las mismas en"imas que se utili"aron ara cortar el ADN que se quiere insertar. 6nir el vector % el ADN que se va a clonar mediante los llamados extremos cohesivos, o egajosos, o escalonados.
6na ve" que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto, o simlemente, inserto. !os tios de vectores que se utili"an suelen ser l*smidos, virus como el fago l, cromosomas creados de forma artificial % quimeras.
. !or"ación del ADN reco"#inante En esta etaa se roduce la unión covalente del vector % el ADN inserto mediante una ligasa. As# se reali"a el sellado de la llamada 7ella, 7uesca o Nic8. $. Introducción del ADN reco"#inante en la c%lula an&itriona 'ara la clonación 4relicación del ADN recombinante5 se necesita la maquinaria celular. 'or ello, ha% que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona. !os tios de células anfitrionas son •
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C%lulas #acterianas' son las m*s utili"adas, %a que tienen una alta velocidad de relicación, un bajo coste de mantenimiento de las colonias % son f*cilmente maniulables. C%lulas eucariotas' aunque las células eucariotas son, en general, dif#ciles de mantener se usan levaduras % células tumorales !evaduras se utili"an en rocesos relacionados con la investigación de la exresión % la regulación génica % la s#ntesis de rote#nas eucariotas.
(élulas tumorales aroiadas en rocesos de clonación, %a que la velocidad de relicación es mu% alta % se mantienen los caracteres sin roducirse cambios, ues son mu% estables.
!os métodos ara la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos de ADN, uesto que la membrana celular es selectiva % no ermitir#a la enetración de grandes moléculas.
(. Propa)ación del cultivo +e induce la división de células anfitrionas, de forma que se roducen también coias de ADN recombinante %, or ello, la clonación. 'rimero se efect&a una siembra en lacas 'etri con agar como medio de cultivo. +e dejan crecer las colonias. (ada una de ellas ser* seleccionada % transferida a distintos medios l#quidos, donde seguir* aumentando el n&mero de individuos de la colonia.
*. Detección + selección de los clones reco"#inantes En los rocesos de clonación se utili"a un gran n&mero de células. Al final del roceso se hace necesario searar las células que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen. !a detección % la selección de colonias se reali"a en los medios de cultivo. En los rocesos de clonación se obtienen células anfitrionas que no han incluido el vector, células recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el ADN ara recombinar, % células anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto. !os métodos ara detectar % seleccionar son •
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M%todo de ,i#ridación' se utili"a una sonda marcada que hibrida con el ADN recombinante o con el A)N mensajero que se transcribe a artir de él. M%todo in"unoló)ico se detecta la rote#na codificada en el ADN recombinante mediante anticueros esec#ficos. M%todos )en%ticos' que, a su ve", ueden ser
$nserción del vector % el ADN recombinante en un gen de la célula anfitriona que queda desactivado. 'or ejemlo, si la colonia no roduce en"ima lactasa, es que el ADN recombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en ese gen. 9ector con genes de resistencia a un antibiótico en el medio se agrega el antibiótico % sólo crecer* aquella colonia que sea resistente a él, or tanto, que orte el ADN.
(olonias con defectos nutricionales se utili"an células anfitrionas mutantes que no uedan sinteti"ar, or ejemlo, un amino*cido. 'ara que la colonia sobreviva, el amino*cido debe ser añadido al medio de cultivo. Emleando un vector que lleve el gen correcto ara la s#ntesis de dicho amino*cido, haciendo crecer las colonias celulares en medios carentes de él sólo crecer*n las bacterias que lleven el ADN inserto.
