UNIVERSIDAD CIENTIFÍFICA DEL SUR
FACULT FACULTAD AD DE MEDICINA HUMANA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR
CURSO: BIOLOGIA CELULAR PROFESOR: ROGER IZIGA GOICOCHEA INFORME DE PRÁCTICAS PRÁCTICA Nº6
TÍTULO: Obtenc!n " An#$%% &e F'(cc)ne% Ce$*$('e%
INTEGRANTES: +
Á,$( Te'')ne%- Ren.)/
+
G*01''e. C(%t(2e&(- 3e'e4/
+
A$,('(&) R)%($e% P(t'c(/
+
Pe&')%( A$)n%) - Seb(%0(n/
HORARIO DE PRÁCTICAS DÍA: MARTES HORA: 5:7 8 9:77 FECHA DE REALIZACIN DE LA PRÁCTICA: 7;<7=<5 FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 79<7=<5
LIMA 8 PER>
OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE FRACCIONES CELULARES
INTRODUCCION (4('c) te!'c) " )b?e0,)% &e $( @'#c0c( MARCO TEORICO Las diferentes metodologías ulizadas para el estudio de la composición celular, entre ellas las técnicas bioquímicas, siológicas, citológicas. Permiten analizar en gran medida la anatomía y localización de las estructuras y organelas celulares. Generalmente el primer paso es obtener fracciones enriquecidas con las disntas estructuras u organelas. na de las técnicas m!s ulizadas para obtener dic"as fracciones es el fraccionamiento celular , el cual e s un con#unto de procedimientos que enen como principal ob#e$o obtener fracciones puras o enriquecidas de un determinante componente celular , ya sea esta una organela como el n%cleo, mitocondrias ,lisosomas , pero&isomas , etc.
'odo procedimiento de fracciones celulares enen ( etapas)
HOMOGENIZADO: Ruptura de las células o te#idos para obtener un lisado celular *o sular+ , de tal modo que se liberen sus componentes , en parcular sus organelas , sin que estos sufran daos y que se encuentren en condiciones adecuadas para su puricación .-n el caso de ruptura e&isten muc"as formas de "allar pero solo se usan dos el método químico y el método mec!nico
FILTRADO: Proceso que consiste en la separación de componentes no deseados presentes en la suspensión celular mediante un medio poroso , que reene sólidos y de#a pasar líquidos .
CENTRIFUGADO O PURIFICACION na que enen todos los componentes celulares libres , es necesario separlo en fracciones , es decir , realizar el fraccionamiento y el método mas ulizado . uando los diferentes componentes celulares se encuentran suspedido en un liquido, enden a sedimentar "acia el fondo por el efecto de la gra$edad .
Objetivos /. 0dencar las fracciones celulares en el "ígado de pollo 1. 2educe el rendimiento y pureza de cada fracción (. so de colorantes que idenquen organelas especicas celulares
34'-504L-6 ) 7 / ubeta con "ielo *no se usó+ 7 / mortero
7 /<< Bl de colorante @oec"st ((1:C
7 /<< Bl de 3ytotrac;er 7 8 gasas
7 /9 tubos ependorf de /,:mL 7 1 bea;er de /<< ml
7 / ca#a de l!minas y laminillas
7 3icroscopio de campo claro y de Duorescencia. 7 /< gr. de "ígado de polio por todo el laboratorio
7 / bea;er de :< ml
7 /<< ml de =erde de >anus 7 /<< ml de bu?er 'ris /< m3 p@ A,:
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
MATERIALES METODOS USADOS
P5E-2030-F'E / 3olemos el "ígado en el motero, aadir 1< ml de la solución 'ris /< m3 p@ A,: y ltramos con la gasa en el bea;er.
1 =ertemos el ltrado en 1 tubos eppendorf y agregue :<< 04 de la solución de bu?er 'ris /< m3 p@ A,:. 5otul!ndose con la palabra n%cleo.
( entrifugue a (<<< rpm durante ( minutos. *-l pellet que "a quedado se denomina fracción nuclear y re suspender en 1<< p./ de 'ris /< m3 p@ A,:+
6obrenadante
Hracción nuclear
8 oloque el sobrenadante del proceso anterior a 1 ependorf nue$os y m!rquelos con la palabra mitocondrias. entrifugar a /<<<< rpm durante C minutos. eliminar el sobrenadante y re suspender el pellet en 1<< /// de bu?er 'ris /< m3 p@ A,:+.
6olo necesitaremos la f. mitocondrial. 4sí que agregamos tris.
Observaciones a microspio de fracción nuclear y mitondrial
4adiremos a unas gotas de 4zul de meleno a la fracción nuclear en la l!mina portaob#etos, cubrimos y $emos lo siguiente.
4l suspendido o fracción mitocondrial aadiremos el colorante mytotrac;er de#!ndolo incubar por /< min a (AI.
RESULTADOS :
8<<& /. I&en0c(c!n &e nc$e)% '(cc!n ce$*$(' )bten&( ( @('0' &e$ (&) &e @)$$)
2espués de "aber somedo la muestra en la centrifuga por ( minutos a (<<< rpm *menor fuerza centrífuga y empo que el de la mitocondria por tener mayor densidad y ser m!s grande+ obtu$imos 4 /<<& una mezcla "eterogénea en el tubo eppendorf , donde se obser$aron dos fases, una en la parte de arriba transparente y un sedimento en la parte inferior de color blanquecino debido a que son m!s -n otra muestra de fracción mitocondrial aadiremos grandes y se sedimentan m!s r!pido en el fondo del eppendorfJ que fue el que ulizamos para $erde de >anus posteriormente colocar /< Bl del re suspendido del tubo marcado como n%cleo en una l!mina portaob#eto y con la ayuda de una gota de colorante azul de meleno y lo cubrimos con una l!mina cubreob#etos , diferenciamos los n%cleos de las células en el microscopio electrónico de campo claro. -n la muestra tomada para la obtención de estructuras nucleares, al someterlas al microscopio con el azul de meleno pudimos obser$ar claramente dic"a estructura -n otra lamina adicionamos /< Bl del colorante @oec"st ((1:C y cubrimos con 4 /<< una & l!mina cubreob#etos, de#amos reposar por 1 min y lo obser$amos en el microscopio de Duorescencia. 4 /<<<&
olorante) 4zul de meleno *Hraccion nuclear+
olorante) 4zul de meleno.
'ubo eppendorf colorante @oec"st ((1:C *Duorescencia+ *fraccion nuclear+ /<<<&
Hraccion nuclear. &e 4t)c)n&'(% '(cc!n ce$*$(' )bten&( ( @('0' &e$ (&) /. I&en0c(c!n
&e @)$$)
Para la obtención de la fracción mitocondrial, se colocó el sobrenadante de la mezcla anterior a /<<< rpm durante C minutos * porque la f racción celular que queremos recuperar es m!s ligera y m!s pequea , se precipitan m!s r!pido, se necesita mayor fuerza centrífuga y empo+ , obtu$imos una mezcla un poco m!s "omogénea, con un sedimento ligeramente claro en el tubo -ppendorf de <,: Bl , adicione : Bl del colorante $erde de >anus en un fros, lo some al microscopio de campo claro y obser$e claramente las mitocondrias, con las caracteríscas que las diferencian como lo son su estructura granular diferencial. -n un ependorf de <,: ml adicione : Bl del resuspendido y : Bl del colorante mytotrac;er de#!ndolo incubar por /< min a (AI y se obser$o lo siguiente )
'ubo eppendorf * tubo mitocondrial+
4 /<< &
C)$)'(nte ) =erde de >anus
F'(cc)n 4t)c)n&'($
C)$)'(nte ) mytotrac;er. *microscopio de Duorescencia+
ANÁLISIS DE RESULTADOS
KPor qué es necesario #untar ciertos colorantes con ciertas estructuras ,e#emplo, queremos e&aminar los n%cleos del "ígado de pollo , pero no podemos poner cualquier colorante , ene que ser uno con car!cter b!sico , ya que, los n%cleos portan 42F y lo que "ace que sea acido es el grupo fosfato y al ec"ar un colorante b!sico
como el azul de meleno lo neutraliza "aciendo que la muestra sea m!s $isible -s necesario "acer todo el proceso de fraccionamiento celularJ ya que, en este caso el "ígado ene muc"as estructuras que no queremos $isualizar y necesitamos centrarnos en lo que realmente queremos por eso tenemos que "omogenizar, ltrar y puricar nuestra muestra para separar todo lo que no nos interesa. -n un microscopio de Duorescencia se pueden apreciar las estructuras me#or, ya que, este se centra en las estructuras internas especícas. -n la muestra tomada de fracción nuclear, al obser$arlas en el microscopio de campo claro con el azul de meleno pudimos obser$ar claramente dic"a estructura, las cuales se caracterizan por ser estructuras m!s oscuras al c entro de las células. Por otro lado en el caso de la obtención de fracción mitocondrial y "aberlas somedo al microscopio con el colorante $erde de >anus, obser$amos la estructura granulosa y rugosa de la mitocondria. Etro aspecto que llegamos a diferenciar fue el grado de sedimentación que ocurrió posterior a colocar los tubos -ppendorf en la centrífuga, pues el tubo rotulado con la letra 3 *mitocondria+ fue somedo a una $elocidad rpm mayor y tambien a un mayor n%mero de minutos, a diferencia del tubo rotulado con la letra F *n%cleo+, que se podría decir que ya que posee una mayor densidad y con la ayuda de la gra$edad, el sedimento fue en$iado al fondo y la diferencia en la mezcla "eterogénea que se produ#o era m!s e$idente. 2ebido a que -l nucleo es mas grande que la mitocondria que es mas ligero y necesita menos empo de cetrifugacion.
DIFERENCIA JUE VIMOS ENTRE LA FRACCION MITOCONDRIAL NUCLEAR
CONCLUSIONES /. se obser$ó la técnica de fraccionamiento celular y se "iso uso de conocimientos en los cuales se reconocía que el mayor peso lo lle$aban los n%cleos el por ello de su e$idente aparición después de la primera centrifugada a menor $elocidad y empo en comparación a la que buscaba la de las mitocondrias. 1. La $isualización de las mitocondrias se "iso m!s dicultosa con el microscopio ópco ,por lo cual se tu$o que "acer uso de im!genes de un microscopio electrónico
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